扶正化积合剂质量标准研究

2015-03-13仕海涛

中国医药导报 2015年6期

仕海涛

[摘要] 目的建立扶正化积合剂的质量控制方法。方法对扶正化积合剂中黄芪、淫羊藿、三七进行薄层色谱鉴别；采用高效液相色谱法对黄芪甲苷进行含量测定。结果扶正化积合剂中黄芪、淫羊藿、三七的薄层色谱均斑点清晰，阴性对照无干扰；黄芪甲苷进样量在0.2102～4.2040 μg范围内线性关系良好（r=0.9997），平均回收率为96.8%，RSD为0.87%（n=6）。结论本研究建立的薄层色谱法和高效液相色谱法专属性强，准确度高，重复性好，可用于扶正化积合剂的质量控制。

[关键词] 扶正化积合剂；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法；黄芪甲苷

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（c）-0091-04

扶正化积合剂是山东省日照市妇幼保健院（以下简称“我院”）自行研制用于治疗气虚血瘀、痰湿积聚，症见疲乏无力、四肢倦怠、精神不振，痰涎壅盛，舌体胖、舌质黯或有瘀斑、瘀点，苔厚腻，脉沉弦滑的医院制剂，处方由黄芪、炙黄芪、仙鹤草、法半夏、茯苓、三七、鸡血藤、淫羊藿、醋鳖甲、砂仁等十味中药组方而成，具有补气扶正、活血化瘀、化痰散结功能，用于晚期肺癌、胃癌、食管癌等见上证者。为了有效控制扶正化积合剂的质量，本文参照《中国药典》2010年版中的有关鉴别方法，采用薄层色谱法对本制剂中三七[1]11、黄芪[1]283、炙黄芪[1]283、淫羊藿[1]306、进行鉴定分析，笔者参照《中国药典》2010年版一部黄芪项下黄芪甲苷的含量测定方法及其有关资料对其中的黄芪甲苷含量进行了测定。结果显示本方法专属性强，简便易操作，结果准确，且重现性好，可用于控制扶正化积合剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-10ATVP高效液相色谱仪及其工作站（日本岛津公司）；精密电子天平（瑞士Sartorius）；HHS21.4电热恒温水浴锅（上海医疗器械三厂）；三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；HS3120超声波清洗器（天津市兰博实验仪器设备有限公司）；GZX-9076MBE型数显鼓风干燥箱温控议（上海博迅实业有限公司医疗仪器厂）。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：0781-200311）；黄芪对照药材（中国药品生物制品检定所提供，批号：120974-200609）；淫羊藿对照药材（中国药品生物制品检定所提供，批号：120941-200807）；三七对照药材（中国药品生物制品检定所提供，批号：110737-200415）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为三重蒸馏水，甲酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、硫酸、三氯甲烷、正丁醇、丁酮、氨水、三氯化铝、氢氧化钠均为分析纯，扶正化积合剂（日照市妇幼保健院制剂室制备，批号：140511、140523、140618、10706），阴性对照品为我院制剂室制备，所用药材均符合《中国药典》2010年版一部有关要求；硅胶G薄层板、硅胶H薄层板（青岛胜海化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

本制剂的鉴别主要是对君药（黄芪、炙黄芪）、淫羊藿、三七进行了鉴别。

2.1.1 黄芪的薄层色谱鉴别取本品10 mL，加乙酸乙酯提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，浓缩至约1 mL，作为供试品溶液。另精密称取黄芪对照药材1.0 g，并加入乙酸乙酯20 mL，超声10 min后滤过，滤液浓缩至1 mL左右，将其作为对照药材溶液。参考《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B项下的薄层色谱法进行试验：各吸取供试品溶液、对照药材溶液均为5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为三氯甲烷-甲醇（8.5∶1.5），进行展开，取出并晾干，置NH3蒸气中熏制，365 nm波长下行紫外光灯检视。供试品溶液色谱图片显示，在与对照药材溶液色谱的相应位置处，呈现相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液色谱显示其他药味无干扰。见图1（封三）。

2.1.2 淫羊藿的薄层色谱鉴别取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1毫升含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取鉴别项下供试品溶液和淫羊藿对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品色谱显示其他药味无干扰。见图2（封三）。

2.1.3 三七的薄层色谱鉴别精密量取本品25 mL，加饱和状态的正丁醇提取，共计3次，每次30 mL，合并其提取液，用1%NaOH溶液洗涤，共计2次，每次25 mL，滤液蒸干，并加入甲醇约2.5 mL溶解，将其作为供试品溶液备用。另取三七对照药材1.0 g，加水10 mL，搅匀，加饱和状态的正丁醇10 mL，均匀振荡10 min，放置2 h，离心取上清液，加3倍量的正丁醇饱和水，振荡均匀，放置并使之分层，取正丁醇层，蒸干，滤液蒸干，并加甲醇约1 mL溶解，将其作为对照药材溶液。参考《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B项下薄层色谱法进行试验，分别吸取供试品溶液、对照药材溶液均为5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，于低于10℃下以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶50∶25∶10）的下层溶液作为展开剂，进行展开。试验完毕，取出薄层板并晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰显现。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，有相同颜色的荧光斑点出现，阴性对照品溶液色谱显示其他药味无明显干扰。见图3（封三）。

2.2 检查

按照《中国药典》2010年版附录Ⅰ J合剂项下的要求，进行相关的检查。

2.2.1相对密度相对密度的检查按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅶ A应不低于1.02，采用比重瓶法测定。结果显示，三批样品（批号：140511、140523、140618）的相对密度测定结果分别为1.06、1.03、1.02。根据三批样品测定的结果，暂确定本制剂的相对密度不得低于1.02。

2.2.2 pH值按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅶ G法测定应为4.0～6.0。结果显示，三批样品（批号：140511、140523、140618）的pH测定结果分别为4.24、4.79、5.24。根据三批样品测定的结果，暂确定本制剂的pH控制在4.0～6.0。

2.2.3 最低装量检查按照《中国药典》2010年版一部附录ⅫC最低装量检查法。本制剂为多剂量包装，每一瓶装量为200 mL。按规定的方法检查，结果表明装量均不小于标示量的97%。

2.3 黄芪甲苷含量测定

2.3.1 色谱条件色谱柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（68∶32）；检测波长：205 nm；柱温：40℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；黄芪甲苷的保留时间为：25.971 min。

2.3.2 黄芪甲苷对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品10.51 mg，用甲醇定容至25 mL的容量瓶中，制成浓度为0.4204 mg/mL的对照品溶液备用。

2.3.3 黄芪甲苷供试品溶液的制备精密量取本品20 mL，用饱和的正丁醇溶液提取，共计3次，每次35 mL，合并滤液，用NH3溶液充分洗涤，共计2次，每次35 mL，弃去NH3溶液，滤液蒸干，并加水约10 mL振摇溶解，室温放置，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径d=1.5 cm，柱高H=12 cm），洗脱，弃去水液，再加30 mL左右的40%乙醇洗脱，弃去洗脱液，并用80 mL左右的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，放干，加甲醇溶液使之溶解，后移入10 mL的容量瓶中，摇匀，即得，备用。

2.3.4 线性关系考察试验精密吸取黄芪甲苷对照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，并取同黄芪甲苷对照品溶液10 μL左右分别进样。以峰面积（Y）对进样量（X）行线性回归，结果回归方程为：Y=1691.615X+4.154，r=0.9997，线性范围为：0.2102～4.2040 μg，表明在此范围内线性关系较好。

2.3.5 阴性空白试验取缺黄芪、炙黄芪的阴性对照品按照扶正化积合剂的方法制备相关溶液，再参考“2.3.3”项下供试品溶液的方法制备阴性对照品溶液，参考“2.3.1”项下的色谱条件进样检测。结果，在黄芪甲苷对照品相同位置上无干扰峰（图4），表明处方中其他药味对黄芪甲苷的测定未形成明显干扰。

2.3.6 精密度试验取对照品溶液，参考“2.3.1”项下色谱条件进样检测测定，连续6次，结果显示，对照品溶液中的黄芪甲苷溶液峰面积的RSD为0.85%（n=6），提示其精密度试验良好。

2.3.7 稳定性试验取样品溶液，参考“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，依据“2.3.1”项下色谱条件进样，分别在0、5、10、15、20、25 h进行测定，结果显示，在25 h内供试品溶液的黄芪甲苷峰面积的RSD为1.04%（n=6），提示该方法稳定性较好。

2.3.8 重复性试验精密量取同一批号的样品（批号：140511）6份，每份10 mL，参考“2.3.3”项下方法制备供试品溶液。结果显示，供试品溶液中黄芪甲苷的平均含量值为0.1417 mg/mL，RSD为0.63%（n=6），提示该方法重复性较好。

2.3.9 加样回收率试验精密量取已知含量的样品溶液6份（批号：140511，测得含量为0.1417 mg/mL），分别准确加入黄芪甲苷对照品，摇晃均匀，参考“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，用外标法计算含量。结果显示，黄芪甲苷的平均回收率为96.8%，RSD为0.87%（n=6）。见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收率试验（n=6）

2.3.10 样品测定取4个批号下的扶正化积合剂（批号：140511、140523、140618、140706），参考“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，依据“2.3.1”项下色谱条件进样，测定其相应的峰面积，以外标法计算样品的含量，测定3次，取其平均值。见表2。

表2 样品测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 试验方法的选择

本研究利用薄层定性来鉴别黄芪、淫羊藿、三七，结果其分离度好，专属性强。另外，在《中国药典》2010年版中，黄芪药材的含量测定方法已经采用HPLC法[1][212]，另有资料显示含黄芪的复方制剂现多采用HPLC法测定黄芪甲苷的含量[2-8]。本文采用HPLC法对扶正化积合剂中黄芪甲苷进行含量测定，操作简单，分离度好，灵敏度高。

3.2 试验波长的选择

采用高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量，需选择适当的波长进行检测。参考《中国药典》2010年版一部项下黄芪采用蒸发光散射检测器检测，由于该检测器普及程度低，不便操作，故笔者参照有关资料[9]选用紫外检测器检测。由于黄芪皂苷种类较多，结构相近，紫外扫描只在200 nm有末端吸收，因此定在200 nm处检测[10-15]，实验表明，波长越长，噪声越小，但灵敏度越低；越靠近200 nm，灵敏度越高，但噪声越大，综合考察这两个因素，本实验选取205 nm作为检测波长，测得的黄芪甲苷峰峰形好，取得了满意的效果。

3.3 试验流动相的选择

在选用流动相时，笔者分别使用甲醇-水（68∶32）[16]、乙腈-水（32∶68）[17]、（40∶60）[18]、（35∶65）[19-20]、（1∶2）[21-22]等进行试验。经多次实验，流动相甲醇-水（68∶32）峰形好，响应值大，理论板数高。流动相乙腈-水（32∶68）峰形好，理论板数虽然高，但响应值略小，其他3种流动相峰形不理想，故笔者以甲醇-水（68∶32）作为流动相，取得了满意的分离效果和测量效果。

3.4试色谱条件的选择

对样品制备时4次正丁醇提取后的水液按“2.3.3”项下方法制备成样品，按既定色谱条件进行检测，结果在黄芪甲苷对照品相同位置处未发现色谱峰，可见本实验采用的提取方法提取率高。

综上所述，本研究建立的薄层色谱法和高效液相色谱法专属性强，简便易操作，结果准确，且重现性好，可用于扶正化积合剂的质量控制。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 宋成英，封加福.HPLC同时测定黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（11）：115-117.

[3] 韩亮，余楚钦，林华庆，等.UPLC-DAD技术快速分析黄芪药材及制剂中主要黄酮成分[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（13）：115-118.

[4] 聂颖兰，范斌，郭娜，等.HPLC-ELSD法测定健脾益肾胶囊中黄芪甲苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（17）：130-132.

[5] 张龙.HPLC-ELSD法测定中药复方黄芪注射液中黄芪甲苷的含量[J].江苏农业科学，2012，40（12）：318-320.

[6] 孙学惠，陈宇峰，吴琼，等.正交试验优选黄芪桂枝五物汤提取工艺研究[J].山西医药杂志，2013，42（9）：486-488.

[7] 徐小芳.用HPLC法测定复方附子口服液中黄芪甲苷的含量[J].药学服务与研究，2013，13（5）：380-381.

[8] 孟楣，魏良兵，王芳，等.UPLC-ELSD法测定芪白平肺胶囊中黄芪甲苷[J].中成药，2013，35（12）：2634-2637.