三氧化二砷诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡的作用

叶　荣，张晓峰，汪　渊

1.210028，武警江苏总队南京医院骨科；2.441300　随州，湖北医药学院附属随州医院病理科

三氧化二砷诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡的作用

叶荣1，张晓峰1，汪渊2

1.210028，武警江苏总队南京医院骨科；2.441300随州，湖北医药学院附属随州医院病理科

【摘要】目的探讨三氧化二砷(arsenic trioxide, AS2O3)诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡的作用。方法将AS2O3按不同浓度(0、4、8 μmol/L)作用于细胞24 h后，分别通过光镜、MTT法、Hochst33342染色检测细胞的凋亡情况，另以8 μmol/L的AS2O3作用细胞，通过流式细胞仪分别在8、16、24 h后，观察细胞凋亡情况。结果AS2O3可抑制骨肉瘤U2OS细胞的增殖，浓度越大，抑制越强，4 μmol/L的AS2O3作用细胞24 h后，增殖率为(66.32±5.15)%，8 μmol/L的AS2O3作用细胞24 h后，增殖率为(26.73±9.36)%，并且作用时间越长，抑制作用越强，8 μmol/L的AS2O3作用于U2OS细胞8、16、24 h后，凋亡率分别为21.16%，36.15%，47.13%。结论AS2O3可诱导骨肉瘤U2OS细胞的凋亡，抑制肿瘤的增殖。

【关键词】三氧化二砷；骨肉瘤；凋亡

【中国图书分类号】R738.1

A study of arsenic trioxide to induce apoptosis of osteosarcoma U2OS cells

YE Rong1, ZHANG Xiaofeng1， and WANG Yuan2.1.Orthopaedic Department, Nanjing Armed Police Force Hospital, Nanjing 210028, China；2.Pathology Department,Suizhou Hospital, Hubei University of Medicne,Suizhou 441300,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of arsenic trioxide on inducing apoptosis of osteosarcoma U2OS cells in vitro. MethodsOsteosarcoma U2OS cells were treated with arsenic trioxide at different concentrations(0，4 μmol/L，8 μmol/L) for 24 h, respectively, then were observed under microscope,by MTT assay and Hochst33342 staining method. U2OS cells were treated with arsenic trioxide at 8 μmol/L and then detected by flow cytometry at 8 h, 16 h and 24 h. ResultsAS2O3could inhibit U2OS cells growth, the U2OS cells proliferation rate was (66.32±5.15)% after treatment with arsenic trioxide at 4umol/L concentration, and (26.73±9.36)% at 8 μmol/L concentration. The U2OS cells apoptosis rate was 21.16%，36.15%，47.13%respectively at 8 h, 16 h, 24 h after treatment with AS2O3. The effect of arsenic trioxide on inhibiting U2OS cells growth is dependent on time and concentration. ConclusionsAS2O3can induce apoptosis of osteosarcoma U2OS cells and inhibit the cells growth.

【Key words】arsenic trioxide; osteosarcoma; apoptosis

AS2O3最早用于急性早幼粒细胞白血病的治疗，目前随着对其研究的深入，发现对于其他系肿瘤细胞也有诱导肿瘤细胞凋亡作用[1,2]。有实验发现，AS2O3对于骨肉瘤可抑制其生长并诱导其凋亡[3]，在临床中已有学者利用AS2O3作为治疗Ⅲ期骨肉瘤的化疗药物[4]。本研究初步探讨了AS2O3对于U2OS骨肿瘤细胞凋亡的作用。

1材料与方法

1.1材料U2OS细胞采购自中科院上海细胞库，三氧化二砷(北京双鹭药业股份有限公司)，溶于胎牛血清 (Gibco公司)培养液中，AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT Sigma公司)，Hochst33342试剂(碧云天生物技术研究所)，电子显微镜、免疫荧光显微镜(日立公司，日本)，细胞培养箱(NUAIRE公司，美国)，流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养U2OS细胞培养于DMEM培养基中(含10%胎牛血清、1%青霉素及链霉素)，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中，2~3 d传代1次。

1.2.2形态学观察0.25%胰酶消化对数生长期细胞，计数后，按5×104/ml将细胞接种于24孔板，待细胞贴壁后，将AS2O3按浓度(0、4、8 μmol/L)作用于细胞24 h后，电镜下观察细胞增殖情况，每组设3个复孔。

1.2.3MTT法检测0.25%胰酶消化对数生长期细胞，计数后，按5×104/ml将细胞接种于24孔板，待细胞贴壁后，将AS2O3按浓度(0、4、8 μmol/L)作用于细胞24 h后，加入MTT液20 μl继续培养4 h，吸去上清液，每孔加DMSO150 μl避光震荡10 min，酶联免疫检测仪在490 nm波长下检测各孔吸光度值。细胞增殖率(%)=AS2O3作用组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.4Hochst33342染色检测将盖玻片于70%酒精中浸泡5 min后，PBS洗3遍，再用细胞培养液洗1遍，置于6孔板内，0.25%胰酶消化对数生长期细胞，计数后，按5×104/ml将细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后，将AS2O3按浓度(0、4、8 μmol/L)作用于细胞24 h后，吸去上清液，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定，过夜后，吸去固定液，PBS洗2遍，加入0.5 ml Hochst33342染色液染色5 min，PBS洗2遍，滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片。免疫荧光显微镜检测，激发波长在350 nm左右，发射波长在460 nm左右。

1.2.5流式细胞仪检测0.25%胰酶消化对数生

长期细胞，计数后，按5×104/ml将细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后，将AS2O3按浓度8 μmol/L作用于细胞。分别于作用8 、16 、24 h后，收集细胞，按照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2结果

2.1AS2O3对U2OS细胞形态的影响未加入AS2O3的U2OS细胞贴壁良好，呈上皮形。而加入AS2O3的U2OS细胞贴壁较少，细胞数量较少，可见较多的细胞凋亡，而且这种凋亡存在浓度依赖性，药物剂量越大，细胞生长越受抑制(图1)。

图1　不同浓度AS2O3作用U2OS细胞24 h后的细胞形态(×40)

2.2MTT结果不同浓度AS2O3(0、4、8 μmol/L)作用于U2OS细胞24 h后的细胞增殖率分别为(91.22±6.28)%，(66.32±5.15)%，(26.73±9.36)%，组间比较有统计学差异(P<0.05)，细胞的增殖率随着药物浓度的上升而下降 (图2)。

图2　不同浓度AS2O3作用U2OS细胞24 h后，

2.3Hochst33342染色检测结果不同浓度AS2O3(0、4、8 μmol/L)作用于U2OS细胞24 h后， Hochst33342染色后，高浓度AS2O3作用U2OS细胞后，可见不少凋亡细胞，细胞核固缩，染色质浓缩，细胞染色加深，低浓度AS2O3作用U2OS细胞后，可见相对少一点的凋亡细胞，而未加入AS2O3的U2OS细胞中凋亡细胞较少(图3)。

2.4流式细胞仪检测细胞检测结果AS2O3可以诱导U2OS细胞的凋亡，细胞凋亡率随着AS2O3作用时间的延长而增加，8 μmol/L的AS2O3作用于U2OS细胞8 、16 、24 h后，凋亡率分别为21.16%，36.15%，47.13%(图4)。

图3　不同浓度AS2O3作用于U2OS细胞24 h后的Hochst染色荧光检测(×40)

图4　流式细胞仪检测U2OS细胞凋亡率

3讨论

AS2O3可通过Bax，Bcl-2，Bcl-xl等多种信号通路促进肿瘤细胞发生凋亡[5,6]。本研究发现，AS2O3对于骨肉瘤细胞的抑制具有明显的时间和剂量依赖性，当AS2O3浓度为4 μmol/L时，即可抑制肿瘤细胞增殖；当浓度达到8 μmol/L时，可更加明显抑制肿瘤细胞增殖。本研究发现，随着作用时间的延长，AS2O3对于骨肉瘤细胞有明显的抑制。本研究利用流式细胞仪测试了在8 μmol/L浓度的AS2O3作用下，从8 h到24 h可见U2OS细胞凋亡率明显增加。既往研究发现小剂量AS2O3主要抑制肿瘤细胞增殖，大剂量才能对肿瘤细胞有杀伤作用，动物实验和体外研究亦发现，对于实体的恶性肿瘤，只有增加AS2O3的浓度才能达到治疗效果[7]。目前的研究认为，AS2O3抑制肿瘤细胞增殖的机制在于诱导肿瘤细胞的凋亡[8]，对白血病的作用机制体现在其可下调肿瘤细胞Bcl-2的表达，或者选择性地与肿瘤细胞结合蛋白结合，从而诱导肿瘤细胞的凋亡[9]，对于骨肉瘤细胞的抑制主要体现在AS2O3抑制了Hedgehog通路的激活导致的细胞凋亡[10]，AS2O3可阻止胶质瘤(glioma-associated oncogene homolog，GLI)相关癌基因靶基因的转录，而GLI1和GLI2可上调Bcl-2和Bcl-xl的表达[11]，从而诱导细胞的凋亡。另外有研究[12]在利用AS2O3抑制尤文肉瘤细胞增殖的实验中发现，AS2O3可直接与GLI靶基因结合从而抑制GLI的转录。活性氧(reactive oxygen species， ROS)是细胞信号转导通路中一个重要的因子，ROS的积聚可导致细胞的凋亡，实验证明暴露于AS2O3的肿瘤细胞可导致细胞内ROS水平的上升，从而导致细胞凋亡[8, 13,14]。过氧化物酶可以通过转化过氧化氢为氧分子和水分子，从而降低细胞内的ROS水平，是清除细胞内ROS和维持细胞生存很重要的机制，过氧化物酶受抑制可导致细胞内清除高水平ROS的能力的降低。AS2O3诱导肿瘤细胞凋亡的作用体现在抑制过氧化物酶，引起ROS积聚[8]。

有研究表明，AS2O3可抑制核转录因子kappa B表达而促进肿瘤细胞发生凋亡[15]，这可能存在争论。另有研究[16]认为，AS2O3诱导细胞凋亡与JNK或者NF kappa B没有必然联系，AS2O3可以增加JNK的磷酸化，但是予以JNK抑制药并不会影响肿瘤细胞的生长，而AS2O3并不会影响NF kappa B的活化[10]。

本研究只是初步探讨了AS2O3对于U2OS系骨肉瘤细胞的抑制作用，初步证实了AS2O3对骨肉瘤细胞有诱导凋亡的作用，并且存在剂量时间依赖性，而AS2O3的作用机制尚需要后期进一步的深入研究。

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(2015-02-15收稿2015-04-27修回)

(责任编辑张楠)

作者简介：叶荣，本科学历，主治医师，E-mail:yerong76@139.com通讯作者：张晓峰，E-mail:zxfzxf1983@aliyun.com