胰岛素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨转换和骨力学性能的影响

林华刚，王　博，张　军，贾红蔚

1.100037，武警北京总队第二医院外二科；2.300052，天津医科大学总医院内分泌科

胰岛素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨转换和骨力学性能的影响

林华刚1，王博1，张军1，贾红蔚2

1.100037，武警北京总队第二医院外二科；2.300052，天津医科大学总医院内分泌科

【摘要】目的探讨胰岛素对于链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠骨量、骨转换状态和骨力学性能的影响。方法单次尾静脉注射STZ制造糖尿病大鼠模型，成模后分为糖尿病大鼠组(DM)、胰岛素治疗组(INS)与正常对照组(CON)，8周后处死，测定3组大鼠血清骨钙素和尿Ⅰ型胶原氨基末端交联肽(NTx)/肌酐(Cr)比值，DEXA方法测定大鼠离体腰椎和股骨骨密度。骨形态计量学方法分析大鼠骨量和骨转换变化情况。采用股骨三点弯曲试验和腰椎压缩试验分析各组大鼠骨力学性能。结果与CON组相比，DM大鼠血清骨钙素和尿NTx/Cr比值降低，DM大鼠腰椎和股骨骨密度降低。与DM组大鼠相比，INS组大鼠血清骨钙素水平增高，尿NTx/Cr比值无变化，INS组大鼠腰椎和股骨骨密度显著增大(P<0.01)，但未达CON组水平。骨形态计量学分析提示与CON组相比，DM大鼠骨小梁骨量[TBV/TTV(12.06±2.48)% vs (24.12±1.84)%, P<0.01]减少，骨形成速率减低[(0.44±0.11) vs (0.78±0.14)μm/d, P<0.01]。与DM组大鼠相比，INS组大鼠骨小梁骨量显著增加[TBV/TTV(19.75±2.43) %, P<0.01]，骨形成速率亦增加[(0.70±0.16) μm/d, P<0.01]。股骨三点弯曲试验显示，与CON组大鼠相比，DM组大鼠最大载荷、弹性载荷、弯曲能量、最大应力均显著减低(P<0.01)。与DM组相比，INS组上述各力学指标均显著增加(P<0.01),但均未达CON组水平。椎体压缩实验提示与CON组大鼠相比，DM组大鼠最大载荷、弹性载荷、能量吸收、弹性模量均显著减低(P<0.01)。与DM组相比，INS组上述各指标亦显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。结论DM大鼠表现为低转换型骨量减少，且骨力学性能下降，胰岛素治疗可以促进骨形成，增加骨量，且能改善DM大鼠的骨力学性能。

【关键词】糖尿病；胰岛素；骨密度；骨形态计量学；骨生物力学测试

【中国图书分类号】R589.5

Effects of insulin on diabetic bone histomorphometric and biomechanical abilities in streptozotocin-treated rats

LIN Huagang1, WANG Bo1, ZHANG Jun1, and JIA Hongwei2.1.Department of Orthopedics, the Second Hospital of Beijing Municipal Corps of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100037,China; 2.Department of Endocrinology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of insulin on bone mass and the condition of bone turnover and bone biomechanical properties in STZ-induced diabetic rats. MethodsOf 45 male SD rats studied, 30 were made diabetic by intravenous injection of streptozocin(50 mg/kg) on day -7. Thirty diabetic rats were randomly divided into 2 groups as group DM and control group. DM group were injected subcutaneously with insulin (6 U/kg/d) regularly.After their sacrifice on the day 56, blood was sampled and serum was separated for the measurement of Ca, P, ALPand OC. The left tibia was dissected for bone histomorphometry analysis. Right femur and lumbar vertebrae(L1-L4) were reserved for BMD test. The left femor was separated for three-point bending test,while the fifth lumbar vertibra was prepared for compression test to reflect the biomechanical properties of bone.ResultsA low-turnover osteopenia was evidenced in diabetic rats by decreased BMD in both femur and lumbar vertebrae, reduced serum OC level, decreased urine NTx/Cr ratio, decreased trabecular volume[TBV/TTV(12.06±2.48)vs(24.12±1.84)%,P<0.01]and bone formation rate[(0.44±0.11) vs (0.78±0.14)μm/d,P<0.01] by bone dynamic study. All these abnormalities except urine NTx/Cr ratio were partly or completely normalized by insulin treatment. The bone densities in vertebrae and femur of diabetic rats significantly decreased(P<0.01). Maximal load, elastic load, bending energy, maximal stress in three-point bending test were conducted,compared with normal control rats. These abnormalities could be partially corrected by insulin teatment(P<0.01).In addition,the fifth lumbar vertibrae of diabetic rats were obviously decreased(P<0.01), and maximal load,elastic load，energy absorbability and elastic modulus during compressing test. By insulin treatment, these indices partially reversed to the normal control level(P<0.01). ConclusionA low-turnover osteopenia is evidenced in STZ-induced diabetic rats with impaired bone biomechanical abilities.All these abnormalities of bone can be partially corrected by the injection of insulin. It shows that insulin can stimulate bone formation dramatically while not influence osteoclastic activity in diabetic rats.

【Key words】diabetic mellitus; insulin; bone mineral density; bone histomorphemetry; bone biomechanical test

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是以胰岛素缺乏、血糖水平升高为特征的一种慢性疾病。其重要的慢性并发症就是DM性骨丢失，可引起骨折发生率增高和骨折愈合延迟[1]。有研究表明，DM骨丢失用胰岛素治疗后可部分纠正[2]。关于胰岛素在改善骨量的同时，能否改善骨的力学性能目前研究有分歧[3，4]。本研究对此问题进一步探究。

1材料与方法

1.1动物与器械SD大鼠(清洁级，军事医学科学院实验动物中心提供)。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma 公司)，大鼠血清骨钙素放射免疫测定试剂盒(北京北方生物技术研究所)，大鼠尿Ⅰ型胶原氨基末端交联肽(Cross-linked N-telopeptide of TypeⅠcollagen，NTx)酶联免疫测定试剂盒(美国ADL公司)，微量血糖仪(罗氏诊断有限公司)，双能X线骨密度仪(PRODIGY型，美国Lunar公司)，骨切片机(德国POLYCUT)，ELF 3200 力学实验机：美国BOSE公司。

1.2方法

1.2.1动物分组和取材取体重约为250 g的2月龄SD雄性大鼠45只，随机分为正常对照(CON)组、糖尿病(DM)组和糖尿病胰岛素治疗(DMI)组，后两组按50 mg/kg体重一次性尾静脉注射STZ造模。给药72 h后和1周后测定大鼠尾尖随机血糖，两次血糖均大于16 mmol/L为造模成功。3组大鼠同步饲养，12 h光照交替，自由摄入相同的去离子水和固体饲料，根据饲料中钙和维生素D3含量，以及每日的摄食量估算，每只大鼠每日约摄入钙50 mg，维生素D31.25 U。成模后8周处死。处死前留取 24 h尿，记录尿量，-40 ℃冰箱保存，以备测定24 h尿钙。ELISA测定尿NTx浓度，同时测定尿肌酐(Cr)浓度，计算NTx/Cr比值。股动脉放血处死动物，留取血标本以备测定血清钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素(OC)水平。分离左侧胫骨近端2/3，行骨形态计量学分析。分离右侧股骨和椎骨(L1～5)，用生理盐水浸透纱布包裹，-20 ℃保存，备做骨密度测量和骨生物力学试验。

1.2.2四环素双标记法在处死动物前14 d和3 d分别进行两次四环素标记，采用盐酸四环素，每日100 mg/kg体重，分上下午两次灌胃。

1.2.3骨密度测定将股骨和椎骨(L1～5)沿长轴放在一个小动物平台上。骨密度仪配备小动物测量软件，测定质控体模的变异系数为0.09%。

1.2.4骨形态计量学分析制备大鼠不脱钙骨切片，骨切片机切成20 μm厚的切片，光学树脂封片。于OLYMPUS光学显微镜和荧光显微镜下，用KONTRON IBA2.0全自动图像处理系统测量自骺板线远端1～5 mm范围内骨组织形态计量学参数。(1)骨形态学参数。TBV/TTV(%)：骨小梁体积(TBV)占全部骨组织体积(TTV)的百分比。MTPT(μm):平均骨小梁板厚度。MTPS (μm): 平均骨小梁板间隙。Tb.N (个/视野): 平均骨小梁接点数。MCW(μm): 平均骨皮质宽度。(2)骨动力学参数。sL.S/TBS(%): 四环素单标表面。dL.S/TBS(%): 四环素双标表面。MS/TBS(%): 骨矿化表面，四环素单标表面的1/2与双标表面之和占骨小梁表面的百分比。DDL (μm): 四环素双标记线间的平均距离。TOS (%):类骨质表面占全部骨小粱表面的百分比。MOSW (μm): 平均类骨质宽度。MAR(μm/d) 矿化沉积率，用两条四环素标记之间的平均距离除以两次给药间隔天数，即每天矿化了多少类骨质MAR=(DDL×π/4)/11。 MLT (d)： 矿化延迟时间：MLT=MOSW/MAR。 Svf(μm /d)：组织水平的骨形成速率，Svf=MAR×MS/TBS。

1.2.5骨生物力学测试

1.2.5.1股骨三点弯曲试验测试过程是将股骨标本缓慢解冻,保持其湿度,自由放置在支架上，曲面向下，使股骨中点、两支点中心与加载点重合，匀速加载至标本断裂，描记出载荷-变形(挠度)曲线。测试温度23 ℃，实验机载荷测量精度0.01 N，位移(挠度)测量精度0.001 mm，支座跨距20 mm，压头直径近似为1.5 mm，加载速度5 mm/min，选用200 N以内的小载荷量程。用游标卡尺测量断骨内径和壁厚，记录并分析实验数据。测试指标包括结构力学指标：最大载荷(N)、弹性载荷(N)、弯曲能量(N·mm)。材料力学指标：最大弯曲应力(N/mm2)、弯曲弹性模量(Mpa)。

1.2.5.2椎体压缩试验将椎体上下端磨平，修整为高度4～6 mm，具有两个平行平面的类圆柱体。用螺旋测微仪测量椎体的高度，显微镜下计算椎骨横截面积。将湿润的腰椎标本置于试验机上，加载速度为2 mm/min，记录实验数据，绘制载荷-变形曲线，其他测试条件同股骨三点弯曲实验。测试指标包括最大载荷(N)、弹性载荷(N)、弹性模量(Mpa)、能量吸收(N.mm)。

2结果

2.1大鼠体重和血糖8周时，DM组体重低于CON组(P<0.01)，血糖高于CON组(P<0.01)。8周时，DMI组体重低于CON组(P<0.01)，与DM组相比无统计学差异，DMI组血糖低于DM组(P<0.01)，但未达正常对照组水平(表1)。

表1　各组大鼠体重和血糖比较　(n=15；

注：与CON组相比，①P<0.01；与DM组相比，②P<0.01

2.2血清钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素和24 h尿钙、尿NTx/Cr比较3组大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶相比无统计学差异。与CON组相比，DM大鼠血清骨钙素水平和尿NTx/Cr均明显减低(P<0.01)。与DM组相比，DMI 组血清骨钙素水平明显升高(P<0.01)，但未达CON组水平。与DM组相比，DMI 组尿NTx/Cr无统计学差异(表2)。

表2　各组大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素和24 h尿钙、尿NTx/Cr比较　(n=15；

注：NTx：Ⅰ型胶原氨基末端交联肽; 与CON组相比，①P<0.01；与DM组相比，②P<0.01

2.3骨密度比较DM组大鼠腰椎骨密度均值(0.107±011)g/cm3，低于CON组(0.149±0.009) g/cm3，差异有统计学意义 (P<0.01)。DM组大鼠股骨骨密度均值(0.099±0.013)g/cm3，显著低于CON组(0.139±0.013) g/cm3(P<0.01)。DMI组大鼠腰椎骨密度均值(0.118±0.110)g/cm3，股骨骨密度均值(0.116±0.018)g/cm3，均显著高于DM组，但未达CON组水平。

2.4骨形态计量学参数比较DM组大鼠TBV/TTV、MTPT、Tb.N 较CON组显著减低(P<0.01)，DM组大鼠MTPS 较CON组显著增加(P<0.01)。DMI组大鼠TBV/TTV、MTPT、Tb.N 较DM组显著增加(P<0.01)，DMI组大鼠MTPS 较DM组显著减低(P<0.01)，但未达CON组水平。3组大鼠MCW相比，差异无统计学意义(表3)。

动力学参数比较显示，DM大鼠单标表面、双标表面、骨矿化表面、类骨质表面、 Svf较CON组显著减低(P<0.01)，DMI组上述指标较DM组显著增加(P<0.01)，且可达CON组水平。3组大鼠DDL、MOSW、 MAR、 MLT相比较，无统计学差异(表4)。

表3　三组大鼠胫骨干骺端形态学参数比较　(n=15；±s)

注：与CON组相比，①P<0.01；与DM组相比，②P<0.01

表4　三组大鼠胫骨干骺端动力学参数比较　(n=15；±s)

注：与CON组相比，①P<0.01；与DM组相比，②P<0.01

2.5骨生物力学测试结果股骨三点弯曲试验表明，与CON组相比，DM 组最大载荷、弹性载荷、弯曲能量、最大应力均显著下降(P<0.01)。与DM组相比，INS组上述各指标均显著增加(P<0.01)，但均未达到正常对照组水平(表5)。

腰椎压缩实验表明，与CON组相比，DM 组最大载荷、弹性载荷、能量吸收、弹性模量均显著下降(P<0.01)。与DM组相比，INS组上述各指标均显著增加(P<0.01)，但均未达到正常对照组水平(表6)。

表5　三组大鼠股骨三点弯曲试验力学指标比较　(n=15；±s)

注：与CON组相比，①P<0.01；与DM组相比，②P<0.01

表6　各组大鼠腰椎(L5)力学指标比较　(n=15；

注：与CON组相比，①P<0.01；与DM相比，②P<0.01

3讨论

本研究采用单次尾静脉注射STZ 50 mg/kg体重的方法制造糖尿病模型。正常对照组、糖尿病大鼠、胰岛素治疗的糖尿病大鼠3组血钙磷水平无显著性差异。DM组大鼠尿钙显著增加，与文献[5]研究一致。

既往研究显示，糖尿病患者骨密度减低[6],而高血糖可抑制成骨细胞分化和增殖[7]。新近研究认为，糖尿病骨质疏松的发生与炎性反应因子密切相关，肿瘤坏死因子α、IL-6有促进骨吸收的作用，与骨密度呈负相关[8]。

本实验研究结果发现，STZ诱导的DM大鼠血清中标志骨形成的OC水平较正常对照组显著减低51%，同时骨吸收的标志物尿NTx较正常对照组也显著减低，提示DM大鼠骨形成和骨吸收速率均有下降，为低转换型骨质疏松。胰岛素干预DM大鼠后血清OC水平较单纯DM组显著增加36%，但未达到正常对照组水平。胰岛素干预后尿NTx水平较DM组无显著变化，提示胰岛素可能主要通过促进骨形成增加糖尿病大鼠骨量。

骨密度和骨形态学参数表明，DM大鼠股骨和腰椎骨密度骨小梁骨量减低，而骨皮质宽度无显著差异。同时发现胰岛素组大鼠股骨骨密度较单纯DM组增加约17%，腰椎骨密度较单纯DM组增加约9%，但均未达到正常对照组水平。胰岛素治疗组骨小梁骨量较单纯DM组显著增加64%，但仍未达正常对照水平。本研究中胰岛素治疗组血糖虽显著低于糖尿病组，但仍高于正常对照组。若糖尿病大鼠骨丢失与高血糖相关，那么胰岛素治疗组骨小梁骨量未达到正常对照组水平，可能与胰岛素组血糖未能降到正常对照组水平有关。

骨动力学参数表明，STZ诱导的DM大鼠骨表面激活率较正常对照组减低，组织水平的骨形成速率和类骨质表面较正常对照组减少，提示STZ诱导的DM大鼠骨形成速度减低造成骨量减少。而胰岛素治疗组大鼠类骨质表面、骨表面激活频率、组织水平的骨形成速率均较DM组加快，且与正常对照组相比，胰岛素组上述各指标均无显著性差异，提示胰岛素通过促进骨形成增加骨量。这与上述血清骨钙素的研究结果相一致。

胰岛素可直接作用于成骨细胞 ，还可刺激成骨细胞样细胞增殖，增加胎鼠颅骨的al-前胶原mRNA的表达，促进胶原合成[9]。胰岛素促进骨形成的作用可解释本实验中胰岛素治疗组血清OC水平增加，股骨和腰椎骨密度增加，骨形态学参数示骨小梁骨量增加，动力学参数显示骨表面激活频率增加，类骨质表面增加，由此计算的组织水平的骨形成速率增加。胰岛素对骨吸收是否有作用，尚需进一步研究。本文的研究结果是STZ诱导的糖尿病大鼠8周时骨形成和骨吸收均减慢，胰岛素治疗促进骨形成，但对骨吸收作用不著。

鉴于骨量和骨强度的变化有时不一致，胰岛素虽可以增加骨量，但是否可改善骨力学性能，减少骨折发生才是临床工作中更为关注的。有研究证明，对于糖尿病大鼠骨折模型，局部微环境中应用胰岛素，在不影响血糖的情况下，胰岛素可直接促进骨折愈合[3]。但也有研究表明，胰岛素治疗不能改善骨愈合能力[4]。

本研究采用力学实验验证了此问题。股骨三点弯曲实验表明，糖尿病组大鼠最大载荷、弹性载荷、弯曲能量、最大应力较正常对照组均显著下降，经胰岛素干预后，上述指标显著改善，但未达正常对照组水平。腰椎压缩实验亦表明，DM 组最大载荷、弹性载荷、能量吸收、弹性模量与正常对照组相比亦显著下降，胰岛素干预后显著改善，但未能达到正常对照组水平。

可以看出，糖尿病大鼠在糖尿病8周时(相当于糖尿病中晚期)骨量减少是一种低转换型骨丢失，以骨形成减慢为主，骨吸收无变化。

本研究在糖尿病初发时即给予胰岛素皮下注射治疗，除有效降低血糖外，还可通过促进骨形成增加骨量，提示临床早期应用胰岛素可以预防糖尿病相关骨丢失，且可以改善骨力学性能，增加骨抗压、抗弯、抗骨折的能力，有很大临床应用价值。

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(2015-03-03收稿2015-04-15修回)

(责任编辑梁秋野)

作者简介：林华刚，硕士，主治医师，E-mail:lhg13910093279@126.com通讯作者：贾红蔚，E-mail:jhw19741011@sina.com