纳米羟基磷灰石／聚酰胺66／富血小板血浆复合物修复兔股骨中段骨缺损的实验研究＊

卢旻鹏，王群波△，董 靖，曹春风，邱 皓，朱水涛，刘佐忠，焦春艳

（重庆医科大学附属永川医院：1.骨科；2.内分泌科 402160）

骨缺损的修复和重建是目前骨科研究领域中的热点课题。纳米羟基磷灰石／聚酰胺66（nano-hydroxyapatite／polyamide 66，n-HA／PA66）复合材料是作者前期开发的具有优良的生物学性能和类骨活性的骨修复材料[1]。富血小板血浆（plateletrich plasma，PRP）是新鲜自体全血经过浓集、分离而得到的血小板浓缩物，其能释放多种生长因子，促进骨细胞增殖、生长、分化[2-3]。国内外许多文献报道PRP与骨修复替代材料复合有协同促进骨缺损的作用[4-7]。本研究将n-HA／PA66和PRP复合，观察其对兔股骨中段骨缺损的修复能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料 n-HA／PA66复合骨修复材料（由四川大学分析测试中心提供，规格：9mm×10mm圆柱体，中空内径2 mm）；掌骨接骨板（由重庆万盛医疗器械有限公司提供，规格：ZSZ（Q）02-5孔）。

1.2 PRP的制备 PRP的制备采用文献[8]的方法。低密度二次离心法制备PRP，其离心与时间乘积的总和为4 000g／min。最终的血小板浓度稳定，约为全血的5.5倍。

1.3 骨缺损模型制备及分组 6～8个月龄健康成年新西兰大白兔（由重庆医科大学实验动物中心提供，雌雄不限），用速眠新（0.2mL／kg）麻醉后，无菌条件下暴露左侧股骨中段，连同骨膜切除股骨1cm，制作节段性股骨中段骨缺损模型。将造模成功的40只成年新西兰大白兔按随机数字表法分为两组，每组20只，其中，实验组植入n-HA／PA66／PRP复合物，对照组植入n-HA／PA66复合物。最后行5孔掌骨钢板内固定，并在钢板两端钢丝捆扎加固，逐层缝合切口。术后所有兔子均分笼饲养，每天分2次肌肉注射青霉素40万U／只，连续3d。

1.4 观察指标

1.4.1 影像学观察 术后2、4、8、12周行兔左股骨X线摄片，观察骨愈合和修复骨缺损情况。术后12周，采用Lane-Sandhu X线评分标准[9]评估自体骨-材料界面骨愈合情况。

1.4.2 大体观察 术后2、4、8、12周时用空气栓塞法处死兔子，取出标本，拆除钢板及钢丝，观察标本骨缺损修复情况及骨痂生长情况。

1.4.3 组织学观察 术后在各规定时间点将植入材料连同两端0.5cm正常骨组织取出，置于10%中性甲醛中固定，脱钙，石蜡包埋，常规以骨缺损区为中心行连续纵行切片，然后行HE染色，光学显微镜下观察材料周围新骨形成情况。

1.4.4 免疫组织化学染色观察 将各规定时间点所制得石蜡切片行血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）免疫组织化学染色，VEGF阳性表达定位于细胞质，呈浅黄色至棕黄色。采用Image Pro Plus 6.0图像分析系统在高倍（×400）视野下对每张切片随机取5个固定测量窗，对平均光密度值进行半定量测定，计算平均值。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，所有数据均以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后一般情况比较 术后3d内所有兔子饮食稍差，活动少，手术伤口无明显红肿、渗液。1周后兔子饮食正常，恢复日常活动。术后所有兔子切口未见明显红肿及异常分泌物，切口均Ⅰ期愈合。

2.2 影像学结果比较 术后第2周见两组材料均与自体骨间间隙清楚，两组材料周围均未见明显骨痂形成。术后第4周，实验组材料两端可见骨痂形成，材料与自体骨界限不清；对照组未见明显骨痂形成，材料与自体骨间间隙仍较清楚。术后第8周，实验组可见材料周围大量骨痂形成，材料-自体骨界面模糊；对照组也可见骨痂形成，但与实验组比较明显较少。术后第12周，两组材料均已和自体骨牢固结合，对位、对线好，内固定钢板在位，可见大量新生骨痂包裹材料，材料-自体骨界面模糊，其中实验组材料周围骨痂量较对照组多（图1）；术后第12周Lane-Sandhu评分结果显示实验组（6.80±2.05）分，对照组（4.20±1.30）分，二者比较差异有统计学意义（t＝2.393，P＝0.044）。

2.3 大体标本观察 术后第2周，两组材料和自体骨交界处均可见肉芽组织包裹，实验侧肉芽组织量稍多，且有部分纤维性连接。术后第4周实验组材料-自体骨交界处表面可见骨痂形成，材料与正常骨组织交界面不清晰；对照组材料-自体骨交界处表面结缔组织较多，有部分纤维性连接，未见明显骨样组织。术后第8周，实验组材料-自体骨交界处表面大部分被骨痂覆盖，对照组材料-自体骨交界处表面可见骨痂形成，骨痂量明显较实验组少。术后12周，两组骨组织形成量均增加，实验组材料-自体骨交界处表面完全被骨痂覆盖，部分材料也被骨痂完全包裹；对照组材料-自体骨交界处表面大部分被骨痂覆盖。

图1 术后12周兔股骨侧位X线片

图2 术后12周病理切片影像学表现（HE，×100）

2.4 组织学结果比较 术后第2周，实验组材料周围可见大量成纤维细胞增生及部分新生骨小梁，小梁间纤维组织富含毛细血管；对照组成纤维细胞增生明显少于实验组，未见明显新生骨小梁。术后4周，实验组可见粗大的新生骨小梁，不同成熟度的骨小梁排列成网状编织骨；对照组可见部分新生骨小梁，但较实验组明显减少。术后第8周，实验组见大量新生骨组织生成，部分与材料纤维结缔组织连接；对照组材料边缘可见成骨细胞、新生骨小梁。术后第12周，实验组可见大量新生骨小梁及板层骨与材料紧密连接；对照组也可见新生骨小梁及板层骨，材料和骨小梁间可见部分纤维结缔组织连接（图2）。

2.5 免疫组织化学染色结果比较 术后第2周，VEGF在新生血管内皮细胞大量表达，在成骨细胞、成纤维细胞也有表达，其中实验组表达阳性率较对照组高。术后第4周VEGF的表达在实验组明显下降，在对照组也呈下降趋势；病理图像分析系统测量显示，随着时间延长，实验组和对照组的VEGF表达均呈逐渐降低的趋势。其中，实验组VEGF表达强度在术后第2、4周时与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），在术后第8、12周时与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组各时间点VEGF表达水平比较（±s）

表1 两组各时间点VEGF表达水平比较（±s）

时间（周）实验组 对照组t P 2 1.843±0.279 1.144±0.338 3.567 0.007 4 1.378±0.193 1.034±0.258 2.386 0.044 8 1.220±0.146 1.014±0.182 1.973 0.084 12 1.040±0.081 0.962±0.137 1.095 0.305

3 讨论

在众多的骨修复材料中，n-HA／PA66复合骨修复材料因具有良好的生物力学性能、生物相容性及生物安全性，备受关注，目前已广泛用于骨缺损的填充及修复，并取得了不错的临床效果[1，10]。但是，n-HA／PA66复合材料早期诱导成骨性能欠佳。梁勇[11]采用n-HA／PA66椎间融合器融合山羊颈椎，结果发现n-HA／PA66椎间融合器组早期成骨性能明显较自体髂骨植骨组差，但当n-HA／PA66复合基因重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）时，其早期成骨性能与自体髂骨植骨相当，说明rhBMP-2能促进材料早期诱导成骨，但rhBMP-2价格昂贵，难以大范围临床应用。如何提高n-HA／PA66复合材料早期诱导成骨性能并尽可能降低成本是目前的研究难点。

PRP是新鲜自体血提取的超生理浓度的血小板浓缩物，PRP中含大量高浓度的生长因子[12]，包括血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、类胰岛素生长因子等，这些生长因子是促进骨再生的关键因素[2]。国内外许多学者发现PRP在体内、体外有明显的促进骨再生的作用[4]。部分学者的研究也证实部分植骨材料与PRP复合后不仅能早期促进新骨形成量，同时还可提高新生骨质量[13-14]，同时，PRP制作相对简单，费用低廉，为此，作者将PRP复合到n-HA／PA66材料上，期望能提高材料早期诱导成骨性能并减少相关费用。动物实验中组织学和影像学观察表明术后第2周实验组开始出现部分新生骨小梁，而对照组不明显，随着观察时间的延长，实验组新骨生长速度和数量明显优于对照组，显示n-HA／PA66复合PRP后良好的早期诱导成骨效应。

目前，认为VEGF在骨修复过程中对新生血管形成及后期骨痂结构形成、改建和矿化有重要作用[15]。本研究发现，术后第2周，实验组VEGF基因强表达，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。随后两组VEGF表达均呈降低趋势，其中实验组术后第2～4周VEGF表达呈急剧下降，术后4～12周时下降趋于平缓。其机制可能为实验组早期由于PRP中含有大量生长因子，使多种组织细胞表现VEGF强阳性表达，从而产生迅速止血、促进血管及骨小梁形成作用，而对照组由于没有复合PRP，其过程等同于一般的骨缺损愈合过程，仅是因为创伤因素（如组织细胞坏死、炎性细胞反应等因素）引起VEGF的表达，故较实验组弱；根据VEGF表达情况及两组组织学观察，可以初步推断实验组PRP促进骨修复的作用最早发生在植入后约2周内，远早于对照组。

本实验利用PRP中含有多种生长因子的特性，与n-HA／PA66复合材料结合后，用于修复兔股骨中段骨缺损。实验结果表明，从大体标本、X线片及组织学观察，术后2周内实验组开始有新生骨组织，可以认为PRP加入n-HA／PA66复合材料后启动了早期活跃的成骨活动，有利于骨缺损的早期愈合，从而保证了后期的成骨效果。

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