实时荧光定量PCR在结核病中的诊断价值*

曹燕珍　胡佳捷　王翠翠　赵　峰

新疆医科大学附属肿瘤医院病理科，新疆乌鲁木齐市　830011

论著

实时荧光定量PCR在结核病中的诊断价值*

曹燕珍胡佳捷王翠翠赵峰

新疆医科大学附属肿瘤医院病理科，新疆乌鲁木齐市830011

摘要目的：探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)在结核病诊断中的价值。方法：收集我院2013-2014年289例疑似结核组织，对组织进行常规组织病理学检查、抗酸特殊染色，并利用FQ-PCR技术对组织中特异性结核分枝杆菌复合物IS986 基因区域进行扩增检测。结果：抗酸特殊染色结果显示，289例疑似结核组织中抗酸染色阳性94例，检出率为32.5%；FQ-PCR检测显示，阳性182例，检出率63.0%。经比对分析，抗酸染色与FQ-PCR的符合率为81.32%。结论：FQ-PCR对石蜡包埋组织中结核分枝杆菌检测率高于抗酸特殊染色。同时应用两种方法可以提高结核病的检出率，可为结核分枝杆菌感染的病理诊断提供更准确的依据。

关键词结核分枝杆菌实时荧光定量PCR组织

The Diagnosis Value of Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Tuberculosis

CAO Yanzhen,HU Jiajie,WANG Cuicui,etal.DepartmentofPathology,TumorHospitalAffiliatedXinjiangMedicalUniversity,UrumchiCity，Xinjiang830011

ABSTRACT Objective:To investigate the value of real-time fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) in diagnosis of tuberculosis.Methods:A total of 289 suspected tuberculosis tissues were collected from 2013 to 2014 in tumor hospitalaffiliated Xinjiang medical university.All tissues were detected with histopathological examination and special staining acid.FQ-PCR was performed to amplify IS986 gene in tissue,which was specificity in mycobacterium tuberculosis complex.Results:The results of acid special dyeing showed that the positive rate was 32.5% (94/289).FQ-PCR results showed that the positive rate was 63.0% (182/289).The coincidence rate of acid fast stain and FQ-PCR was 81.32%.Conclusion:The detection rate of FQ-PCR are higher than acid dyeing for mycobacterium tuberculosis. Combined two methods can improve the detection rate of tuberculosis, and provide more accurate basis for the pathological diagnosis of mycobacterium tuberculosis infection.

KEY WORDS Mycobacterium tuberculosis,Real-time fluorescent quantitative PCR,Tissue

结核病是由病原菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染引起的可侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏的慢性传染病[1]。结核病诊断的金标准是痰涂片或者培养找到结核分枝杆菌，但在临床应用中，抗酸染色组织病理学也是非常重要的检查手段，但抗酸特殊染色阳性率非常低[2]，使结核病的确诊具有一定的难度。

实时荧光定量PCR (FQ-PCR)技术已广泛用于各种病原体的核酸检测，鉴于其具有的较高的灵敏度和特异性，常应用于血液、痰、胸腹腔积液和脑脊液等标本结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)的检测[1, 2]。结核分枝杆菌的TB-DNA检测病理改变不典型的病例未见报道。本文在组织样本的病理学HE染色和抗酸特殊染色诊断的基础上，采用FQ-PCR法对新疆地区的疑似结核杆菌感染的石蜡包埋组织进行TB-DNA检测，从而进行比较研究，为结核病的诊断治疗的新方法提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料采用连续取样的方法选取我院2013-2014年以坏死性上皮样肉芽肿性病变为主要组织学改变，并被病理科医师怀疑为结核的石蜡包埋组织病例289例，其中维吾尔族96例，回族11例，哈族7例，其他民族175例。FQ-PCR反应的对照设置：阴性质控品：空白蜡块，同时提取DNA并做FQ-PCR；空白参照品：加入超纯水替代DNA；临界阳性质控品、阳性质控品：试剂盒提供的商品化产品，其实质为质粒DNA。

1.2仪器与试剂MX3000P real-time PCR仪(美国安捷伦公司)。石蜡组织DNA提取试剂为美同Omega公司产品；抗酸染色液为中国台湾Baso公司产品；结核分枝杆菌核酸检测试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸扩增荧光试剂盒(国药准字S20063011)。

1.3FQ-PCR检测

1.3.1样本DNA提取： 1ml二甲苯和无水乙醇混合离心1min，弃上清液，重复2次以去除石蜡和二甲苯；后加入220μl TL和20μl OB蛋白酶，56℃水浴4h以消化组织；90℃水浴1h，室温离心1min，取上清液加入220μl BL，随后分别加入无水乙醇，500μl HB，500μl Washing Buffer，室温离心1min，弃滤液；将HiBind柱移置新的无菌1.5ml EP管中，加入已56℃预热的Elution 100μl，室温静置10min，离心1min。用微量核酸蛋白分析仪测量样本DNA的浓度和纯度，OD 260/280值介于1.8~2.2之间的为合格样本，提取的DNA原液保存于-20℃冰箱中，以作备用。

1.3.2PCR程序：93℃ 2min预变性；93℃ 45s变性结束后；55℃ 60s，先做10个循环；93℃ 30s，55℃ 45s(收集荧光信号)、再做30个循环；37℃ 1s延伸。

1.3.3判定标准：CT值<39.0时，结果判读为阳性；CT值=40或无CT值时，结果判断为阴性；阴性质控品CT值应为0.0或无数值；阳性质控品CT值≤37.0时，报告为阳性；临界阳性质控品CT值>37.0的样品，应重复检测，复查结果CT值<40均可报告阳性，否则为阴性。阴性质控品CT值>临界阳性质控品CT值>阳性质控品CT值，则本次实验有效；否则，实验无效。

1.4抗酸特殊染色检测样本组织切片厚3μm，使用TO生物透明剂进行脱蜡，10min重复1次，余步骤按照试剂盒说明书进行；检测结果解释：结核分枝杆菌呈亮红色，呈杆状或螺旋状、单个或成簇排列。其他细菌及细胞呈蓝色。

1.5统计学处理采用SPSS17.0进行数据处理和统计分析，分析不同检测方法阳性率对比检验；采用卡方检验进行数据间的统计分析，当P<0.05为存在差异且有统计学意义。

2结果

2.1FQ-PCR与抗酸特殊染色检测结果分析在289例疑似结核组织中，抗酸特殊染色法阳性94例； FQ-PCR法如图1，阳性病例182例，见表1，其差异具有统计学意义(P<0.05)。其中抗酸染色检查与FQ-PCR检查吻合率为81.32%，不符合率为18.68%。

图1　FQ-PCR检测结果

注：A：FQ-PCR法检测TB-DNA阴性；B：FQ-PCR法检测TB-DNA阳性。

2.2染色阳性特殊病例分析分枝杆菌属包括3大类：结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌[2]。289例疑似结核病例中有4例特殊病例，其共同特点是FQ-PCR结果显示没有有效扩增，但是抗酸特殊染色后发现大量分枝杆菌。鉴于IS986 基因区域的特异性，其中1例在排除结核分枝杆菌感染和麻风分枝杆菌感染后，考虑为非结核分枝杆菌感染；另外3例诊断为麻风分枝杆菌感染。

表1　抗酸染色法与FQ-PCR法检测结核

2.3疑似结核特征分析本研究涉及的疑似结核组织在性别和民族上差异较小，发生部位出现的差异见表2：淋巴结(121例，41.8%)，肺组织(102例，35.3%)，腹膜、胸膜、甲状腺、乳腺、附件、盆腔、四肢、消化道等(66例，22.8%)。可见淋巴结感染率较全身其他部位较高。

表2　FQ-PCR法检测不同部位结核分枝

3讨论

Ziehl-Neeslen抗酸特殊染色法虽然应用广泛，但对结核病的诊断存在局限性。首先，非特异性，有100余种分枝杆菌也是可以呈抗酸染色阳性；其次，抗酸杆菌的形态、大小的变化较大，导致结果判断存在差异；再者，菌体分布不均，客观漏诊[3]。FQ-PCR可以巧妙的将核酸扩增(PCR)、杂交及光谱技术相结合，通过加入荧光标记探针，从而实现对检测样本中结核分枝杆菌的检测。随着该技术的广泛应用，不规范的实验操作和实验室布局会导致假阳性检测结果的出现。所以笔者在289例疑似结核病例的基因扩增实验中，在实验操作细节上，特别注意了以下几点：密闭性、加样完全、一次性耗材的使用、专区专用、避免污染。

本实验中289例抗酸特殊染色阳性率为32.5%(94/289)，FQ-PCR检测阳性率为 63.0%(182/289)，对比分析：抗酸特殊染色的阳性率及敏感性相对偏低，同时对相同样本的疑似结核组织进行FQ-PCR检测，阳性率和敏感性均高于抗酸特殊染色。目前，FQ-PCR标准化检测方法已成为国家药品监督管理局(CFDA)批准的只针对结核分枝杆菌DNA特异性体外扩增的检测方法，其对麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌并不能进行有效扩增，且其具有简便、灵敏、耗时短的优点[4]。而抗酸特殊染色法要求病理医师必须逐张切片、逐个区域进行仔细查找菌体，且结果的判读存在一定的人为因素，缺乏标准化和规范化[5]。但是脱离组织形态学的分

析，FQ-PCR检测并不能准确反映组织中是否存在麻风分枝杆菌或非结核分枝杆菌等的感染情况，所以易造成漏诊情况。

综上所述，同时采用抗酸特殊染色和FQ-PCR检测可以互补两种检测方法中存在的不足。二者结合，使结果判读避免主观差异，可提高结核病的检出率，对结核病的病理诊断起到十分重要的作用。

参考文献

[1]戴佩佩，裘晓乐.三种检测方法对活动性结核病的临床诊断价值〔J〕.中国卫生检验杂志，2011，21(7)：1748-1749.

[2]Lima SS,Clemente WT, Palaci M,etal.Conventional and molecular techniques in the diagnosis of pulmonary tuberculosis:a comparative study〔J〕.J Bras Pneumol,2008,34(12):1056-1062．

[3]谭笑.结核病实验室快速诊断方法的研究〔J〕.湖南师范大学学报：医学版，2007，4(2)：58-59．

[4]韦毅，支成斌，孙桂兰，等.PCR(FQ-PCR)检查在肺结核诊断中的临床价值〔J〕.中国卫生产业，2014，12(28)：156-157.

[5]孙亚欣，张志超，董美玲，等.108例结核病变组织抗酸染色结果分析〔J〕.中国实验诊断学，2011，15(9)：1586-1587．

(编辑雅文)

收稿日期2015-07-03

*基金项目：新疆医科大学附属肿瘤医院科研启动基金(肿2013-01)

中图分类号：R521

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)23-3178-03