羊流产衣原体的分离鉴定及间接免疫荧光法检测

赵荣，李兆才，曹小安，周继章

(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046)



羊流产衣原体的分离鉴定及间接免疫荧光法检测

赵荣，李兆才，曹小安，周继章*

(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046)

对收集的疑似衣原体感染的羊流产胎儿样本接种鸡胚卵黄囊进行分离培养，通过PCR-RFLP(限制性片段长度多态性分析)方法鉴定为流产衣原体。将收集到的流产衣原体阳性样本接种Hela229细胞，应用基于流产衣原体MOMP单克隆抗体的间接免疫荧光法，在Hela229细胞浆内可见呈绿色荧光的衣原体包涵体，进一步在病原学水平上确定发生在甘肃省肃南县羊流产的病原为流产衣原体。

流产衣原体；分离鉴定；PCR-RFLP；间接免疫荧光法

流产衣原体(Chlamydiaabortus)是羊地方性流产的病原[1]，也能引起猪、牛等多种动物在妊娠晚期发生流产[2]。主要寄生于牛、羊、猪等多种动物生殖道黏膜表面的上皮细胞，造成生殖道黏膜受损，引发母畜流产、产死胎、弱胎等，偶尔会感染妊娠妇女，引起急性感染或流产[3]。在我国，自20世纪80年代以来，猪、羊等动物衣原体病[4]在宁夏[5]、青海[6]、陕西[7]等多个省、市、自治区均有发病和大面积流行的报道[8-9]。有流行病学调查结果显示，部分地区牧场的衣原体阳性率高达80%，该疫病的发病情况呈逐年上升的趋势，已经造成巨大的经济损失，严重影响我国畜牧业的健康发展[10]。

2014年，甘肃省肃南县某羊场部分怀孕羊突然在妊娠晚期发生流产，产死胎、弱胎现象严重，给羊场造成了严重的经济损失。根据临床症状，初步怀疑为羊衣原体病。为尽快控制疾病的流行，对病原进行了分离鉴定。目前，最常用的动物衣原体检测方法是间接血凝方法(IHA)。该法操作简便，省时快捷，适用于血清学调查，但无法区分衣原体属下面的不同种，而且判定结果是用肉眼进行观察，容易出现误判。为此，本研究通过病原的分离培养、间接免疫荧光染色等病原学方法进行了确诊检测。

1 材料与方法

1.1 材料 4份病料为采集自甘肃省肃南县的疑似衣原体感染的4只羊流产胎儿肝脏和脾脏；流产衣原体标准株SX5、鹦鹉热衣原体CpL和反刍动物衣原体E58为本实验室分离保存菌株；SPF鸡胚购自兰州市榆中县种鸡场；Hela229细胞购自ATCC，由本实验室传代后于液氮中保存；DMEM/HIGH GLUCOSE培养基购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自Biological Industries (BI)公司；胰蛋白酶-EDTA溶液购自Solarbio公司；放线菌酮购自Sigma公司，用PBS溶液配制成浓度为1 mg/mL的储存液，0.22 μm细菌滤器过滤分装保存；DEAE-dextran购自Sigma公司，用PBS溶液配制成浓度为30 mg/mL的储存液，0.22 μm细菌滤器过滤分装保存；鼠抗流产衣原体MOMP单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；FITC标记的羊抗鼠IgG抗体购自KPL公司；Giemsa染液购自Solarbio公司；洗涤缓冲液是含0.1% Triton x-100和1 mg/mL BSA的PBS溶液。

1.2 方法

1.2.1 羊流产衣原体的分离 将采集的羊流产胎儿的肝脏和脾脏等研碎后，用适量含卡那霉素(50 μg/mL)和链霉素(100 μg/mL)的生理盐水稀释，4 ℃放置4 h，再以2000 r/min离心30 min，取上清，接种于7日龄鸡胚卵黄囊中。弃去接种后3 d内死亡的鸡胚，收集4～9 d死亡鸡胚的卵黄囊膜，连续传代。若初次接种分离时，未致死鸡胚再盲传3～4代直至鸡胚有规律死亡。提取收集的卵黄囊膜所有DNA，进行PCR检测，阳性培养物于-80 ℃保存，进行进一步鉴定。

1.2.2 PCR检测 为鉴定样本是否为衣原体感染，以收集的4～9 d死亡鸡胚的卵黄囊膜基因组为模板，根据GenBank公布的流产衣原体helicase gene clone 8的核苷酸序列，设计针对流产衣原体helicase gene clone 8的引物，以样本基因组为模板，进行PCR扩增。上游引物：5’-TGGTATTCTTGCCGAC-3’；下游引物：5’-GATCGTAACTGCTTAATAAACCG-3’。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40个循环；最后72 ℃延伸7 min。扩增产物用含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的片段的大小[11-12]。同时将流产衣原体标准株SX5、鹦鹉热衣原体CpL和反刍动物衣原体E58，一起进行PCR扩增。

1.2.3 限制性片段长度多态性分析(RFLP) 将helicase gene clone 8 基因的PCR扩增片段用限制性内切酶Alu I消化，20 μL消化液中含PCR产物10 μL、灭菌去离子水7 μL、10×buffer 2 μL、AluI 1 μL，混匀后置37 ℃过夜，65 ℃或80 ℃ 20 min将酶灭活，消化产物用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳检测[11-12]。

1.2.4 流产衣原体的细胞培养 常规方法于96孔板中培养Hela229细胞，待长成单层后，以含30 μg/mL DEAE-dextran的DMEM培养液预处理10 min，接种适量衣原体阳性的鸡胚卵黄囊膜悬液，每孔100 μL，3000 r/min离心60 min，37 ℃、5% CO2培养箱内放置2 h，弃掉接种液，每孔加入200 μL含10% FBS和0.5 μg/mL放线菌酮的DMEM培养液，37 ℃、5% CO2培养箱内培养48 h后观察结果。

1.2.5 流产衣原体包涵体的Giemsa染色检测 样本接种细胞48～72 h进行Giemsa染色检测衣原体包涵体，具体操作步骤如下：吸出细胞培养孔内的衣原体生长培养液，用无水甲醇固定单层细胞10 min，空气中充分挥发，加Giemsa染液染色30 min，用95%乙醇快速洗涤1次或PBS洗涤3次，干后镜检。

1.2.6 流产衣原体包涵体的间接免疫荧光法检测细胞于接种48～72 h后，吸弃孔内的培养液，用4 ℃预冷PBS洗涤2次，-20 ℃无水甲醇固定单层细胞10 min[13]，预冷洗涤缓冲液(Washing Buffer, WB)振荡洗涤3次，每次3 min；加入鼠抗流产衣原体MOMP单克隆抗体100 μL(用10% FBS 50倍稀释)，4 ℃过夜孵育，预冷WB振荡洗涤3次，每次3 min；加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体100 μL(用10% FBS 100倍稀释)，37 ℃避光孵育45 min，用预冷WB振荡洗涤5次，每次3 min；DAPI染色5～10 min，然后用预冷PBS振荡洗涤3次，每次3 min；最后在荧光显微镜下观察，并拍照。

2 结果

2.1 PCR检测结果 依据设计的引物，对4份样本进行了扩增，其中3份均获得约479 bp的单一目的片段，一份为阴性，与预期标准值相符，PCR扩增产物电泳结果见图1。

1,9: DNA Ladder 100; 2:C.abortus SX5; 3:C.psittaci CPL; 4:C.pecorum E58; 5,6,8:阳性样本；7:阴性样本图1 helicase gene clone 8基因的PCR结果

2.2 RFLP结果 通过对helicase gene clone 8 基因的PCR扩增片段用限制性内切酶AluI消化，得到了如图2所示的结果。

2.3 Giemsa染色检测结果 普通光学显微镜下观察，在感染的Hela229细胞胞浆中可见椭圆形或帽状的衣原体包涵体，胞浆淡染，包涵体呈蓝紫色(图3箭头所示)。

2.4 间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，IIF)检测结果 将接种流产衣原体分离株48～72 h的Hela229细胞固定后，以抗流产衣原体MOMP单克隆抗体进行荧光染色，在荧光显微镜下观察，在感染的Hela229细胞内可见蓝色的细胞核旁呈绿色椭圆形或帽状的流产衣原体包涵体(图4)。

3 讨论与小结

本研究通过设计衣原体种特异性引物helicase gene clone 8的引物，对样本基因组进行了PCR扩增。虽然反刍动物衣原体也可引起羊流产，但是PCR未能扩增出E58菌株helicase gene clone 8基因，说明造成甘肃肃南县羊的衣原体性流产不是由反刍动物衣原体引起的。对于流产衣原体和鹦鹉热衣原体的区分早有报道[12,14]，本研究对helicase gene clone 8基因PCR扩增产物经AluI消化后进一步RFLP分析，鹦鹉热衣原体CpL helicase gene clone 8片段未被切开，仍为479 bp，而阳性样本的helicase gene clone 8基因则被切为两个片段，这与流产衣原体标准株SX5的特征一致，说明本次羊流产是由流产衣原体导致的。

为了从病原学上进一步的鉴定，本研究在Hela229细胞上对分离到的衣原体进行了培养。分别采用Giemsa染色法和基于流产衣原体MOMP单克隆抗体的间接免疫荧光法对流产衣原体包涵体进行检测，从Giemsa染色情况来看，可以观察到有衣原体的包涵体形成，但无法确定为流产衣原体。通过进一步的间接免疫荧光观察，Hela229细胞内可见蓝色的细胞核旁呈绿色椭圆形或帽状的衣原体包涵体，这从病原学上再次证明，本次羊流产是由流产衣原体引起的。间接免疫荧光法在人沙眼衣原体的分离鉴定上，素有“金标准”之称，但是对于动物衣原体病原学诊断方面除PCR之外，在细胞培养上还未建立起好的诊断方法，因此，本研究所建立的间接免疫荧光诊断技术不仅为将来建立动物衣原体细胞感染诊断奠定基础，也为将来通过细胞培养获得流产衣原体感染滴度、制备动物衣原体灭活疫苗奠定前期的科学基础。

总之，本研究通过对肃南县羊流产物鸡胚分离，通过PCR-RFLP鉴定、Giemsa染色以及间接免疫荧光检测，确定该地区的羊流产为流产衣原体所导致，这为药物治疗及疫苗防控提供了科学依据。

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(编辑：李文平)

Isolation and Identification of OvineChlamydiaabortusand Detection with Indirect Immunofluorescence

ZHAO Rong, LI Zhao-cai, CAO Xiao-an, ZHOU Ji-zhang*

(StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResarchInstitute,ChineseAcedemyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China)

The sample was collected from the suspectedChlamydiaabortus(C.abortus) infected fetal, which was inoculated into the SPF embryonated chicken eggs.It was identified asC.abortusby PCR-RFLP method.The sample which was PCR-RFLP positive was inoculated on Hela229 cell and then the whole cell inclusions ofC.abortuswere detected by indirect immunofluorescence assay (IIF) based on anti-C.abortusMOMP monoclonal antibody.Chlamydial inclusion of green fluorescence could be seen in the cytoplasm of Hela229 cells by IIF.It indicated on etiology level that the abortion in sheep in Sunan country was caused byChlamydiaabortus.

Chlamydiaabortus; isolation and identification; PCR-RFLP; indirect immunofluorescence

赵荣，硕士研究生，从事动物疫苗与分子免疫研究。

周继章。E-mail:zhoujizhang@126.com

2015-08-25

A

1002-1280 (2015) 11-0021-04

S852.67