贵州部分少数民族遗传性痉挛性截瘫Spastin 基因突变研究

庄俊鸿，徐 坚，李小丽

遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia，HSP)又称为家族性Strumpell-Lorrain 病，是一种临床及遗传高度异质性的神经系统遗传病，患病率为2/10 万～9.6/10 万，临床多表现为缓慢进展的双下肢无力及痉挛性截瘫。主要的遗传方式有常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive，AR)和X-连锁隐性遗传(X-linked recessive，XR)。1983 年Harding 教授将HSP 分为单纯和复杂二型［1］。目前已被发现的HSP 基因型有40 余种［2～9］，已克隆的疾病基因有20 个［10］，新近可能有更多的致病被克隆。但在HSP 致病基因中，常染色体显性遗传(AD-HSP)最为多见，占70%～80%，其中Spastin 基因突变所致的遗传性痉挛性截瘫4 型(spastic paraplegia-4，SPG4)约占AD-HSP 的40% 左右［11］。国内报 道SPG4 在我国AD-HSP 家系中的突变率为18.2%和20.8%［12～14］，2004 年中南大学课题组报道中国汉族人群的AD-HSP 的Spastin 基因微突变频率为18%［15］，并推测8 号外显子是中国人Spastin 基因突变热点，中国人HSP 基因诊断可优先考虑筛查Spastin 基因8 号外显子［12，16］，首次提出我国总体人群HSP 基因诊断的一种思路。众所周知，我国可是一个多民族的人口大国，区域间的民族分布特点不尽相同，汉族与少数民族、少数民族间HSP 的Spastin 基因突变情况是否一致，目前尚无文献具体报道。鉴于此，为了解我国少数民族人群Spastin 基因突变的情况，我们率先收集到贵州地区9 例少数民族HSP 患者，进行Spastin 基因外显子突变的研究分析。

1 对象与方法

1.1 研究对象 9 例HSP 患者为2009 年～2012 年贵阳医学院附属医院神经科收治的5 例HSP 患者及经过调查家系中其他家庭成员发现符合HSP 的4 例患者。当中2 例为散发患者，截止现在无发现家族的遗传史。所有患者均严格参照1983年Harding 提出的临床诊断标准进行诊断［1］，并由贵阳医学院附属医院神经内科两位主任医师的专家进行病史的询问及详细的体格检查。其中家系1 的2 例患者(Ⅲ1、Ⅲ5)来自贵州省大方县布依族，家系2 的1 例患者(Ⅱ2)来自贵州清镇苗族，家系3 的4例患者(Ⅳ1、Ⅳ27、Ⅴ24、Ⅴ25)来自贵州省六盘水市彝族，家系图谱见图1;2 例散发患者(S1、S2)分别来自贵州省贵阳市彝族和兴义市的布依族，本研究得到所有参与者的知情同意。

图1 布依族、苗族、彝族3 个家系图谱

1.2 DNA 制备 取3 个家系内7 例HSP 患者、2 例散发HSP 患者及家系外100 例无血缘关系的健康对照者的外周抗凝静脉血各7～10 ml，使用DNA 提取试剂盒，按照厂家给出的使用方法提取外周血DNA，DNA 保存于-20 ℃冰箱。

1.3 引物设计与合成 根据Genebank 提供的人类正常基因组序列，委托生工生物工程(上海)有限公司设计Spastin 基因1-17 号外显子引物并合成上下游引物，1、17 号外显子较大，分别设计2 对和4对引物，所有引物扩增序列覆盖了各外显子与内含子交界区。

1.4 PCR 扩增 Spastin 基因外显子2、8、10、13、14 的PCR 总反应体积各为25 μl，其中Master mix(含 dNTP、Mgcl2、Taq 酶、Tris 液等)各为12.5 μl，dd H2O 各为6.5 μl、7.5 μl、7.5 μl、9.5 μl、7.5 μl，Primer1(上游引物)和Primer2(下游引物)分别各为2 μl、2 μl、2 μl、1 μl、2 μl，DNA 各为2 μl、1 μl、1 μl、1 μl、1 μl，PCR 反应程序:94℃预变性5 min→94 ℃变性45 s→外显子2、8、10、13、14退火45 s(退火温度分别为66 ℃、56 ℃、56.8 ℃、59 ℃、67 ℃)→72 ℃延伸45 s→30 个循环后再延伸5 min。外显子1(1)、1(2)、3、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17(1)、17(2)、17(3)、17(4)的PCR 总反应体积各为50 μl，其中Master mix(含dNTP、Mgcl2、Taq 酶、Tris 液等)各为25μl，ddH2O 各为22.5 μl，Primer1(上游引物)和Primer2(下游引物)分别各为1 μl，DNA 各为0.5 μl;PCR 反应程序:94 ℃预变性2 min→94 ℃变性30 s→退火30 s(退火温度分别为62 ℃、62 ℃、55 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、63 ℃、55 ℃、55 ℃、55 ℃、65 ℃、57 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、59 ℃)→72 ℃延伸30 s→30 个循环后再延伸2 min。扩增仪上进行扩增，制备1.2～1.5%琼脂糖凝胶电泳检验PCR 扩增产物，每孔加PCR 产物5 μl，取一孔加5μl DL 2000Marker 或DNA MarkⅠ600 作参照，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压设为10 V/cm，根据片段大小电泳相应时间，在UVP 凝胶成照相观察结果并记录。

1.5 DNA 序列分析 1-17 号外显子PCR 产物电泳后均出现清晰的特异性条带，每个PCR 产物合计为30～50 μl 封存并-20 ℃冰箱保存，分别委托生工生物工程(上海)有限公司、北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序。每个测序结果与人类基因组Spastin 基因序列进行比对(Genebank 序列号AJ246003.1)，Dnastar 软件分析结果。测序结果异常者重提其DNA 再行PCR 扩增，进行产物正反向测序加以验证。

2 结果

对9 例HSP 患者进行Spastin 基因1-17 个外显子DNA 直接测序，测序结果与人类基因组Spastin基因序列进行比对后，只有发现在家系3 中两例患者(Ⅴ24、Ⅴ25)的Spastin 基因第4 号外显子在同一位点上发生错义突变c.847C＞T，同时经基因筛查该家系其它的23 名家庭成员(Ⅲ18、Ⅳ3、Ⅳ5、Ⅳ9、Ⅳ11、Ⅳ25、Ⅳ30、Ⅳ32、Ⅳ37、Ⅳ39、Ⅳ41、Ⅴ1、Ⅴ2、Ⅴ3、Ⅴ4、Ⅴ8、Ⅴ22、Ⅴ23、Ⅴ26、Ⅴ27、Ⅴ28、Ⅴ29、Ⅴ30)及家系外100 例无血缘关系的健康对照者，未发现该位点的突点，推测该位点的突变可能为一多态;另外突变位电均位于外显子序列前后的内含子区域，Spastin 基因第4 号外显子测序图结果见图2。

图2 Spastin 基因第4 号外显子测序图结果

3 讨论

HSP 是一种具有高度遗传异质性的神系统变性疾病，分子水平筛查突变致病基因是HSP 诊断的金标准，当前把Spastin 基因作为HSP 首选筛查的候选基因。根据文献报道:HSP 的基因的突变频率存在种族间不同［17］，最高为韩国人群［18］，最低为北美人群［19］。亚洲的中国汉族人群spastin 基因的突变率为18.2%，低于日本人41.6%［20］和韩国人64%［21］，表明Spastin 基因突变与种族人群、地域的差异有一定联系［17］。在国内，我们还有56 个民族，少数民族占到55 个，其中贵州的少数民族个数多达54 个。他们大多在偏远地区聚集而居，民族间较少或严禁通婚，生活环境相对封闭，形成了遗传学上相对隔离的人群。所以，我们选择探索贵州地区的少数民族人群spastin 基因的突变的特点，期待在该领域得到一定的规律价值。

本次筛查的Spastin 基因由Hazan 等［22］定位克隆并命名，包含有17 个外显子，跨越约110 kb，蛋白含有616 个氨基酸。目前对Spastin 基因的发病机理尚未完全阐明，可能是Spastin 突变使得微管不能及时解聚，打破了微管聚合或解聚的动态平衡，微管骨架调控系统受损，从而干扰了轴突运输而致SPG4［23］，当然也有其它的学说成功报道。我们还注意到，Spastin 基因已在果蝇建立了动物模型，它主要的突变类型有错义突变(30%)、缺失突变(19%)、剪接位点突变(18%)［15］，突变的位点覆盖Spastin 各个区域，但大多数点突变位于AAA 盒，该盒定位在spastin 基因序列内的342～599 氨基酸，错义突变主要定位在第7～16 外显子之间［2～9］，剪接位点突变几乎都位于外显子5～1 6［24］。在2009年黄尚志教授［25］就已报道:除外显子4 之外，每个外显子均有突变报道。然而，经我们筛查的9 例HSP 的Spastin 基因1～17 号外显子，只发现Spastin基因在一个常染色体显性遗传家系3 中两例患儿(Ⅴ24、Ⅴ25)的第4 号外显子发生点突变c.847C＞T。同赵国华等［12］报道的点突变是中国人主要突变形式相一致，但突变位点不在AAA 盒，也不在4～16 外显子之间。可见本组资料研究的9 例少数民族并没有支持5～16 外显子是优先考虑筛选的外显子，并有待更大样本量进一步说明。家系内成员未有该位点突点，考虑为基因的多态。

这2 例携带Spastin 基因4 号外显子点突变的患者V24、Ⅴ25 在家系3 中表现为遗传早现，分别于5 岁、3 岁时起病，在SPG4-HSP 相关的文献已有报道［26～31］，被认为是减数分裂的不稳定，3 个核苷酸重复扩增的动态突变所致，截止目前我们的研究尚未找到相吻合的突变。再之，我们的研究结果得出该家系两例患儿的父亲及先证者不携带Spastin基因4 号外显子点突变，同时进一步筛查该家系内自愿参与抽血的23 例成员及100 例无血缘关系的健康对照者，均未有该位点突变。以上结果经反复再实验验证及分析对比赵坤等［17］报道一个AD-HSP家系在先证者发现一个位于SPG4 上新型杂合突变，再对家系内现症患者筛查发现与先证者相同的突变位点，并发现2 例症状前患者，国内见有多篇类似的文献报道［32］，可推测我们发现c.847C＞T 是一种多态，不是该家系的致病基因。该位点的突变可能由Ⅴ24，Ⅴ25 这两兄弟的母亲(Ⅳ28)传递给他们，只可惜母亲已去世，未采集到血标本，实验过程中无法验证，有待我们积极去联系Ⅳ28 的直系亲属，从Ⅳ28 的直系亲属中去寻找这一碱基变异。

同时我们还注意到，四川大学刘凌等［33］报道过一个症状明显的AD-HSP 家系，筛查该家系所有患者的Spastin 基因1～17 号外显子也均未发现突变，推测与其它基因型有关。同样，我们在贵州地区研究的9 例少数民族HSP 患者的Spastin 基因1-17 号外显子也未能找出致病基因，有可能该区域的Spastin 突变率低于全国。其原因可能有如下两方面:(1)少数民族与汉族民族突变的热点可能不同，不排除存在区域差异性。(2)我们纳入的样本量少，部分少数民族Spastin 基因突变特点尚与我们研究的目的存在偏差。但需指出的是，截止目前，笔者的研究课题组也未发现新的少数民族HSP 病例，单独收集少数民族的HSP 病例实属难度较大，纳入较大样本量的研究目前不易做到。此外，虽然全国各地陆续有HSP 突变在不同人群的报道，可我们根本不了解民族间有无差异。从近几年文献报道中，西南地区(贵州、四川)的Spastin 突变的阳性率很低，造成HSP 基因诊断的成本代价很高，对我们未来在临床上开展遗传咨询、基因诊断、症状前诊断、基因治疗带来极大挑战和困难，给患者、家人、社会增加更多经济负担。

综上所述，我们现阶段的研究未能得出少数民族与汉族人群HSP 较为明确的异同点，但我们研究的目的在于探索出一条更适合我国不同民族的筛查途径，为将来不同民族与区域的人群HSP 致病基因筛查提供参考，可节省很多人力物力，从而给HSP患者带来福音，帮助患者逐代消除HSP，满足生健康下一代的要求。

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