脑红蛋白在脑梗死大鼠表达及丁苯酞干预效应

闫莹莹，娄季宇，白宏英，杨霄鹏，焦义明，乐 婷，刘海燕

脑红蛋白(neuroglobin，NGB)是Burmester 等［1］发现的主要表达于神经系统的第三类携氧珠蛋白，与氧有很高的亲和力，促进氧传递到线粒体，提高脑组织氧利用率。NGB 减少氧化应激诱导的ROS/RNS 过表达和脂质过氧化作用，抑制线粒体功能障碍、凋亡及细胞死亡［2］。降低NGB 表达会增加组织和细胞缺氧损伤程度，缺血/缺氧可启动NGB 对神经细胞的保护，从而为治疗脑卒中的候选药物。丁苯酞(NBP)具有明确抗脑缺血作用，但其具体的机制未完全明了。本文旨在研究NBP 是否调节脑缺血大鼠NGB 表达，减少氧化应激损伤，从而为NBP治疗脑梗死患者提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性SD 大鼠90只，体重280g～350 g，购自河南省实验动物中心(合格证号SCXK(豫)2010-0002)。随机分为假手术组、模型组、治疗组。每组按术后处死时间分为3 个亚组:1 d、3 d 和7 d，每亚组10 只。

1.2 药物和主要试剂 NBP 原料药由石药集团恩必普药业有限公司提供，批号518120502。以植物油制成浓度为32 mg/ml 溶剂用于动物灌胃。RT-PCR 试剂盒和Trizol 购自Transgen 公司，引物购自北京博大泰克公司;NGB 单克隆兔抗鼠抗体购自美国Sigma 公司;SOD、MDA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。图像采集使用德国Lecia 显微照像系统，图像分析系统为上海山富科学仪器有限公司(Biosens Digital Imaging System v1.6)。

1.3 方法

1.3.1 给药方法 治疗组于术后2 h 按80 mg/kg 丁苯酞植物油灌胃，假手术组和模型组予等量植物油灌胃，每天2 次。

1.3.2 实验动物模型建立 10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射(ip)麻醉，仰卧位固定，颈部备皮，消毒，颈部正中切口，钝性分离各层组织，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，结扎ECA 远心端，动脉夹夹闭CCA 及ICA，剪断ECA，沿ECA 残端向ICA 插入鱼线，进入长度约18 mm±0.5 mm 时，可感阻力，停止插线，ECA 残端结扎并固定鱼线。清理切口，逐层缝合。术后60W 白炽灯直接照射保持肛温37 ℃。假手术组只分离，不结扎，不插线。

采用Longa 等［3］制定的5 级神经功能缺损评分法对脑梗死大鼠术后3 h 和各时间点处死前行行为学评分。1 分以上为模型制作成功，选择评分在1～3 分大鼠为实验对象，剔除神经损伤太重或无损伤大鼠并予以补充。

1.3.3 标本采集及保存 每组大鼠于相应时间点处死，随机取5 只心脏灌注4%多聚甲醛后取脑，4%多聚甲醛固定24 h 后石蜡包埋保存。其余5只断头新鲜取脑，液氮迅速冷冻后移于-80℃冰箱保存。

1.3.4 RT-PCR 检测 NGB mRNA Trizol 一步法提取脑组织总RNA，用紫外分光光度计定量，取少量用于RNA 含量及纯度测定。总RNA 先用RNase H 处理后，用RT-PCR 试剂盒进行cDNA 的合成及PCR 反应。通过大鼠NGB cDNA 序列设计引物，如下:上游:5’-CCGCAGCCCTCTGGAACAT-3’;下游:5’-TGTAGAGCAGGGACTCACCTA-3’;扩增产物长度296 bp。以GAPDH 为内参照，引物序列为上游:5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’;下游:5’-TGATGGCATGGACTGTGG-3’;扩增产物长度506 bp。PCR 反应条件:94 ℃预变性2 min，一个循环;94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环，72 ℃总延伸6 min。PCR 扩增目的产物进行电泳并对目的条带用凝胶分析系统进行分析，对目的条带与内参GAPDH 的DNA 条带灰度值的比值进行相对含量计算。

1.3.5 免疫组化法检测NGB 表达 大鼠脑组织石蜡切片5 μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS洗3 次，高压抗原修复5 min，自然冷却，PBS 冲洗3次，用二抗同源血清进行封闭，甩掉血清，滴加一抗50 μl，室温下孵育1 h;滴加二抗50 μl 室温孵育15 min，DBA 显色，苏木素复染，脱水，透明及封片。100 倍镜下观察，400 倍镜下计数阳性细胞数，同时采用图像分析系统进行分析。

1.3.6 化学比色法检测SOD 活性和MDA 含量 将新鲜脑组织用磷酸盐漂洗3 次，除去血液、滤纸拭干，精确称重后制备10%匀浆，3000 r/min 离心15 min，取上清液按测试盒说明书进行SOD 活性和MDA 含量检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行数据录入和处理，计量资料用 表示，多组间多时间点比较采用析因方差分析，进一步分析分组单独效应，方差齐时两两比较采用LSD 法，方差不齐时采用Dunnett’s T3 法，两独立样本比较采用t 检验，检验水准=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分 除术后3 h 外，治疗组神经功能评分均低于模型组;不同时间点之间两组神经功能评分差异有统计学意义(P＜0.05)，术后3 h 评分开始增加，1 d 达峰，随后逐渐下降;分组和时间之间存在交互效应(P＜0.05)(见表1)。

2.2 NGB mRNA 表达 不同组间NGB mRNA差异有统计学意义(P＜0.05)，模型组较假手术组高，治疗组较模型组高;不同时间点间NGB mRNA差异有统计学意义(P＜0.05)，假手术组各时间点NGB mRNA 差异不明显，模型组和治疗组NGB mRNA 表达随时间延长逐渐降低;分组和时间之间存在交互效应(P＜0.05)(见表2、图1)。

2.3 NGB 蛋白表达 不同组间NGB 差异有统计学意义(P＜0.05)，模型组较假手术组高，治疗组较模型组高;不同时间点间NGB 差异有统计学意义(P＜0.05)，假手术组各时间点NGB 差异不明显，模型组和治疗组NGB 表达随时间延长逐渐下降;分组和时间之间存在交互效应(P＜0.05)(见表3)。

2.4 SOD 活性、MDA 含量检测 不同组间SOD 活性和MDA 含量差异有统计学意义(P＜0.05)，SOD 活性模型组较假手术组低，治疗组较模型组高、较假手术组低;MDA 含量模型组较假手术组高，治疗组较模型组低、较假手术组高;不同时间点间SOD 活性和MDA 含量差异有统计学意义(P＜0.05)，假手术组各时间点SOD 活性和MDA 含量差异不明显，模型组和治疗组SOD 活性和MDA 含量表达均随时间延长逐渐下降;分组和时间之间存在交互效应(P＜0.05)(见表4、表5)。

表1 各时间点模型组和治疗组神经功能评分比较(±s)

表1 各时间点模型组和治疗组神经功能评分比较(±s)

分组主效应:F 组间=26.947，P=0.000;时间主效应:F 时间=19.579，P=0.000;交互效应:F 交互=4.842，P=0.006。#表示与模型组比较，P＜0.05

表2 各时间点3 组间NGB mRNA 表达比较(±s)

表2 各时间点3 组间NGB mRNA 表达比较(±s)

分组主效应:F 组间=1224.040，P=0.000;时间主效应:F 时间=252.000，P=0.000;交互效应:F 交互=64.980，P=0.000。* 表示与假手术组比较，P＜0.05;#表示与模型组比较，P＜0.05

表3 各时间点3 组间NGB 平均光密度值比较(±s)

表3 各时间点3 组间NGB 平均光密度值比较(±s)

分组主效应:F 组间=173.903，P=0.000;时间主效应:F 时间=25.374，P=0.000;交互效应:F 交互=12.352，P=0.000。* 表示与假手术组比较，P＜0.05;#表示与模型组比较，P＜0.05

表4 大鼠脑组织3 个时间点SOD 活性(U/mgpro)(±s)

表4 大鼠脑组织3 个时间点SOD 活性(U/mgpro)(±s)

分组主效应:F 组间=245.01，P=0.000;时间主效应:F 时间=20.059，P=0.000;交互效应:F 交互=9.405，P=0.000。* 表示与假手术组比较，P＜0.05;#表示与模型组比较，P＜0.05

表5 大鼠脑组织3 个时间点MDA 含量(mmol/mgpro)(±s)

表5 大鼠脑组织3 个时间点MDA 含量(mmol/mgpro)(±s)

分组主效应:F 组间=448.833，P=0.000;时间主效应:F 时间=121.918，P=0.000;交互效应:F 交互=26.699，P=0.000。* 表示与假手术组比较，P＜0.05;#表示与模型组比较，P＜0.05

3 讨论

脑是机体代谢率最高的器官，缺血时造成细胞能量代谢紊乱，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生过多，氧化应激损伤，在脑缺血后神经元损伤中起关键作用。如何改善脑梗死患者能量代谢和降低氧化应激损伤，成为科研和临床工作重点。NBP 是从芹菜种子中分离出的有效成分，又叫作芹菜甲素，可阻断缺血性脑卒中所致损伤的多个病理环节，具有较强抗脑缺血作用。明显缩小大鼠局部脑缺血梗死面积，减轻水肿，改善能量代谢和缺血区微循环和血流量，抑制神经细胞凋亡，以及抗脑血栓形成和抗血小板聚集等药理作用［4］。

NGB 是继血红蛋白和肌红蛋白之后发现的携氧珠蛋白，主要表达在脊椎动物神经系统和视网膜细胞中［5］。目前研究揭示了NGB 作为内生性神经保护因子，在脑梗死和其他神经系统疾病中起作用，关于其机制进行了很多研究。Li 等［6］离体研究证实NGB 通过PTEN-AKT 通路促进轴突再生。Khan等［7］研究认为NGB 通过抑制膜死亡传导信号复合体形成来保护神经元免受NMDA 和β 淀粉样蛋白毒性作用。Li 等［8］认为NGB 具有抗氧化特性，减少氧化应激损伤。本实验结果显示NGB 主要在神经元表达，神经胶质细胞也有少量表达，与既往研究结果相符。模型组较假手术组、治疗组较模型组NGB 表达增高，提示脑缺血时机体启动了内生性保护因子，减少急性应激损伤。而且丁苯酞可上调NGB 表达减少脑缺血损伤。试验中NGB 表达随时间呈下降趋势，提示其表达已于24h 内达到高峰，即缺血引起NGB 上调已达最大程度。如果刺激持续存在，神经细胞缺血缺氧亦进一步加重并超出自身代偿能力，NGB 表达降低，使细胞供氧进一步下降，缺氧情况急剧恶化，细胞功能丧失并走向死亡。

在脑梗死病理生理中，氧化应激占有重要地位。ROS 过量产生不仅引起脂质、蛋白和DNA 等重要细胞成分氧化，也改变脑梗死中重要信号通路，最终引起细胞损伤和死亡［2］。脑缺血时细胞受自由基攻击引发链式脂质过氧化反应，形成大量脂质过氧化物，其中以MDA 毒性最大，间接反映机体细胞受自由基攻击严重程度。SOD 是机体清除氧自由基，阻断自由基病理性连锁反应最重要的防御酶，其活性测定作为清除氧自由基能力主要指标。实验结果显示，模型组较假手术组脑组织中MDA 含量显著升高，SOD 活性显著降低，表明脑缺血诱发了脑组织氧化应激损伤。随着时间变化，MDA 含量逐渐减少，SOD 活性逐渐升高，可能与ROS 作为机体内抗氧化应激系统信号分子，上调SOD 表达，调控其自身水平有关［9］，启动脑内代偿机制。治疗组较模型组MDA 含量下降，SOD 活性升高。提示NBP 可提高脑梗死大鼠SOD 活性，降低MDA 含量。其可以对抗自由基，拮抗过氧化损伤，可能与抑制黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶反应系统中超氧阴离子自由基形成有关。Burmester 等［10］认为NGB 有提供氧气和减少ROS 损伤作用，Watanabe 等［11］研究认为NGB 通过抑制氧化应激引起的cAMP 浓度下降，保护损伤细胞。NBP 可能也通过上调NGB 表达，间接减少氧化应激损伤，发挥对缺血性神经元保护作用。

综上所述，NBP 对缺血大鼠脑损伤有保护作用，机制可能为上调缺血脑组织NGB 表达，提高SOD 活性，增加氧供，改善能量代谢，促进自由基清除，对抗脂质过氧化损伤，进而降低MDA 含量，稳定细胞膜，改善脑组织病理变化，提高神经元对缺血缺氧耐受性。这可能为NBP 治疗脑梗死提供一些理论依据。但NBP 如何上调MCAO 大鼠脑组织中NGB 表达，减少氧化应激损伤需要体外细胞培养进一步研究。

图1 不同时间点不同组NGB mRNA 表达比较

［1］Burmestern T，Weich B，Reinhardt S，et al.A vertebrate globin express in the brain［J］.Nature，2000，407:520-523.

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［3］Zea Longa EL，Weisnstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84-91.

［4］端木寅，王 源，梁 爽，等.丁苯酞脑缺血治疗作用的相关药理学研究进展［J］.中药药理与临床，2012，28(3):126-129.

［5］De Marinis E，Marino M，Ascenzi P.Neuroglobin，estrogens，and neuroprotection［J］.IUBMB Life，2011，63(3):140-145.

［6］Li L，Liu QR，Xiong XX，et al.Neuroglobin proments outgrowth via differential binding to PTEN and AKT［J］.Mol Neurobiol，2014，49:149-162.

［7］Khan AA，Mao XO，Banwait S，et al.Neuroglobin attenuates betaamyloid neuro toxicity in vitro and transgenic Alzheimer phenotype in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci，2007，104(48):19114-19119.

［8］Li RC，Morris MW，Lee SK，et al.Neuroglobin protects PC12 cells against oxidative stress［J］.Brain Res，2008，1190(23):159-166.

［9］Yu ZY，Poppe JL，Wang XY.Mitochondrial mechanisms of neuroglobin’s neuroprotection［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2013，Article ID 756989，11pages，http://dx.doi.org/10.1155/2013/756989.

［10］Burmester T，Hankeln T.What is the function of neuroglobin［J］.Exp Biol，2009，212:1423-1428.

［11］Watanabe S，Takahashi N，Uchida H，et al.Human neuroglobin functions as an oxidative stress-responsive sensor for neuroprotection［J］.J Biol Chem，2012，287(36):30128-30138.