致敏树突状细胞治疗小鼠肝癌的实验研究*

刘艳平　马　丽

哈尔滨医科大学附属第一医院　1　干部病房　2　消化内科，黑龙江省哈尔滨市　150001

论著

致敏树突状细胞治疗小鼠肝癌的实验研究*

刘艳平1马丽2

哈尔滨医科大学附属第一医院1干部病房2消化内科，黑龙江省哈尔滨市150001

摘要目的：探讨肝癌细胞致敏的树突状细胞(DC)治疗小鼠肝癌的作用。方法：取BALB/c小鼠胫骨和股骨的骨髓细胞，应用rmIL-4、rmGM-CSF、 LPS、RPMI-1640培养基制备DC。H22小鼠肝癌细胞灭活后与DC按1∶3混合培养，制备肝癌细胞致敏的DC(DC-H22)。实验分为DC治疗组、DC-H22治疗组、生理盐水治疗组。各组分别腹腔注射后2周观察肿瘤体积的变化、抑瘤率及生存期。结果：(1)治疗前各组间的肿瘤体积基本相同，不同治疗2周后，DC治疗组、DC-H22治疗组小鼠肿瘤体积较生理盐水治疗的对照组显著性减小，说明DC及DC-H22治疗小鼠肝癌可以显著抑制皮下移植肿瘤的生长，而H22致敏的DC对肿瘤的抑制程度更大。(2)DC治疗组、DC-H22组治疗2周后，其抑瘤率分别为31.08%、68.30%，小鼠的存活期亦较盐水对照组延长。结论：小鼠肝癌细胞致敏的树突状细胞能够更好地抑制小鼠肝癌的生长，对肝癌的治疗有重要意义。

关键词癌肝细胞树突状细胞小鼠

*项目支持：黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11551303)。通讯作者：马丽

Experimental Study on Therapy of Sensitive Dendritic Cells in Mice Liver Cancer

LIU Yanping#,MA Li.#DepartmentofCadreWard，theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HarbinCity，HeilongjiangProvince150001

ABSTRACT Objective:To investigate the role of dendritic cells (DC) pulsed with hepatoma cells in the treatment of mice liver cancer.Methods:Take BALB/c marrow cells from mice tibia and femur bone and use rmIL-4,rmGM-CSF,LPS,RPMI-1640 media in preparation of DC. Inactivated H22 hepatoma cells of mice mixed with DC(1∶3) cultured for preparation of DC(DC-H22) sensitized by hepatoma cells.The experiment were divided into DC treatment group,DC-H22 treatment group and saline-treated control group.Two weeks later,each group were observed changes in tumor volume, tumor inhibition rate and survival after intraperitoneal injection, respectively.Results:(1)Before treatment tumor volume is substantially the same between the groups, two weeks after different treatment,tumor volume of DC treatment group and DC-H22 treatment group compared with saline-treated control group were significantly reduced, indicating that DC and DC-H22 treatment of mice liver cancer significantly inhibited subcutaneous tumor growth, and H22 sensitized DC have more inhibitory effect on tumor growth.(2)After two weeks, the inhibition rates were 31.08%, 68.30% in DC treatment group and the DC-H22 treatment group,the survival of the mice were also longer than the saline control group.Conclusion:Dendritic cells pulsed with mice hepatoma cells are better able to inhibit the growth of liver cancer in mice, they are important for treatment of liver cancer.

KEY WORDS Liver cancer，Hepatoma cells，Dendritic cells，Mice

近二十多年来，肿瘤组织树突状细胞(DC)的存在与肿瘤的转移及预后的相关性的研究逐年增多，以DC为基础的肿瘤疫苗治疗也是目前的研究热点[1，2]。目前DC的体外培养已经是一项常用的生物治疗技术，单个核细胞来源的DC最为常用。肿瘤疫苗的制备方法可分为四类：(1)特异性肿瘤抗原肽负载DC；(2)肿瘤细胞抗原负载DC；(3)肿瘤细胞-DC融合体疫苗；(4)肿瘤细胞RNA或cDNA负载DC[3]。本实验制备小鼠H22肝癌细胞致敏的DC(即肝癌-DC融合疫苗)，观察其对小鼠皮下移植肝癌的抑制作用及肝癌小鼠生存期的影响，模拟临床肝癌的治疗过程，为进一步应用于临床肝癌的治疗和防止复发奠定实验基础。

1材料与方法

1.1材料雌性BALB/c小鼠，4~6周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠肝癌H22细胞株，购自上海拜力生物科技有限公司。主要试剂：重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte-maerophage colony stinalating factor,rmGM-CSF),重组白细胞介素4(recombinant mouse interleukin 4,rmIL-4)、购自美国PeproTech公司，脂多糖(Lipopolysacchrides,LPS)购自Sigma公司。RPMI-1640培养基，购自Gibco公司。抗小鼠CD1a-FITC、抗小鼠CD86-FITC，购自BD Pharmingen公司。抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD80-PE-Cy5，购自eBioscience公司。

1.2小鼠骨髓DC的制备将BALB/c小鼠颈椎离断处死，取其胫骨和股骨，用1ml注射器吸取RPMI-1604培养基，刺穿骨骺端冲洗骨髓腔，将所得悬液离心、洗涤，重悬细胞于10%胎牛血清的RPMI-1604培养基。调整收获的骨髓细胞的浓度至1×105/ml~1×106/ml，加入rmIL-4(终浓度10ng/ml)和rmGM-CSF(终浓度20ng/ml)培养，保留贴壁细胞；隔日半量换液，培养至第6天收集所有吹吸后的悬浮细胞。调整收集细胞的浓度为1×105/ml~1×106/ml，加入LPS刺激24h使其成熟，用0.4%台盼蓝染色后，用血细胞计数板计活细胞数，活细胞数在95%以上，进行DC的光镜观察。

1.3DC表面标记分子的检测收集最终制备的悬浮细胞，用磷酸盐缓冲液洗两遍(1 000r/min离心，5min)，用流式细胞仪专用细胞固定液调整细胞浓度至1×106/ml，取300μl细胞悬液分别加入1μl的抗小鼠CD1a-FITC抗体、抗小鼠CD11c-PE抗体、抗小鼠CD80-PE-Cy5抗体、抗小鼠CD86-FITC抗体，并避光孵育30min。用2ml的流式细胞仪专用细胞固定液洗两遍(1 000r/min离心5min)，重悬细胞后用流式细胞仪检测荧光标记。

1.4H22肝癌细胞致敏的DCH22小鼠肝癌细胞以30μg/ml丝裂霉素灭活后与DC按1∶3混合，以50%PEG 37℃作用lmin，RPMI-1640培养基稀释后培养24h。

1.5建立皮下荷瘤鼠模型将生长良好处于对数生长期的H22 细胞接种于小鼠右后腿根部，细胞浓度5×105/只，建立皮下荷瘤小鼠模型，2周后可见所有接种小鼠均生长出肿瘤，3~4周后待小鼠肿瘤平均直径长至0.8cm左右即可用于实验。

1.6动物分组BALB/c小鼠随机分为实验组与对照组，每组12只。观察指标：肿瘤体积、抑瘤率、生存期。实验组分为DC治疗组、DC-H22治疗组，对照组为生理盐水治疗组。DC及DC-H22注射治疗2周后再次皮下注射H22肝癌细胞(每组4只)。

1.7DC接种给荷瘤小鼠腹腔内注射DC、DC-H22、生理盐水，1周后重复注射，2周后测量肿瘤直径，计算肿瘤体积、抑瘤率。公式：V=LW2/2(mm3)，V为体积，L为瘤体的最大直径，W为垂直直径。抑瘤率(%)=[1-(治疗组开始平均瘤体积-治疗组结束平均瘤体积)/(对照组开始瘤体积-对照组结束平均瘤体积)]×100%。

1.8统计学分析用SPSS17.0，各组肿瘤体积的比较用One-Way ANOVA方差分析，生存期比较用单因素方差分析。

2结果

2.1DC光镜下形态观察分离的骨髓细胞体积小、圆形，经rmIL-4、rmGM-CSF和LPS作用后，观察到呈半贴壁状态的细胞形态不规则、大小不一、聚集成团，逐渐发展为贴壁生长、胞体增大、树突状突起，在高倍镜下细胞表面可观察到较多毛刺样突起，呈现典型的成熟DC形态。

2.2细胞表型特征制备的DC，CD1a、CD11c及CD86、CD80呈现高表达。

2.3DC对肿瘤体积的影响见表1。

表1　三组治疗对H22荷瘤小鼠肿瘤体积的影响(mm3)

单因素方差分析(体积变化)结果：(1)方差齐性检验Levene检验，P=0.580，可认为方差齐(P>0.05)。(2)方差分析表(ANOVA)表明，F=79.214，Sig=0.000，按α=0.05水准，拒绝H0，接受H1，故可认为三组的治疗前、后体积变化有差别。(3)多重比较检验(Post Hoc Tests)表明，三组之间的体积变化有显著性差别(P<0.05)。说明：治疗前各组间的肿瘤体积基本相同，不同治疗2周后，DC治疗组、DC-H22治疗组小鼠肿瘤体积较生理盐水治疗的对照组显著性减小，说明DC及DC-H22治疗小鼠肝癌可以显著抑制皮下移植肿瘤的生长，而致敏的DC对肿瘤的抑制程度更大。

2.4抑瘤率及生存期观察见表2。单因素方差分析(生存期)结果：(1)方差齐性检验Levene检验，P=0.565，可认为方差齐(P>0.05)。(2)方差分析表(ANOVA)表明，F=71.146，Sig=0.000，按α=0.05水准，拒绝H0，接受H1，故可认为三组的生存期有差别。(3)多重比较检验(Post Hoc Tests)表明，三组之间的体积变化有显著性差别(P<0.05)。说明：DC治疗组、DC-H22组治疗2周后，其抑瘤率分别为31.08%、68.3%，小鼠的存活期亦较生理盐水对照组延长。

表2　三组治疗对H22荷瘤小鼠治疗后

2.5复种H22肝癌细胞治疗2周后再次于对侧后腿根部皮下接种H22肝癌细胞，荷瘤小鼠未见明显抑瘤作用。

3讨论

近 20 余年来，有关肿瘤组织中DC浸润程度与肿瘤转移及临床预后关系的报道陆续出现，DC 的

基础性研究及以DC 为基础的肿瘤疫苗治疗正成为研究的热点[4，5]。利用DC来诱导机体抗肿瘤免疫已成为肿瘤免疫治疗的新途径，其核心问题是如何在体外进行DC肿瘤抗原的特异性修饰，从而发挥最大的特异性抗肿瘤作用。

本实验应用H22肝癌细胞致敏的DC治疗荷瘤小鼠，结果显示治疗前各组间的肿瘤体积基本相同，不同治疗2周后，DC治疗组、DC-H22治疗组小鼠肿瘤体积较生理盐水治疗的对照组显著性减小，说明DC及DC-H22治疗小鼠肝癌可以显著抑制皮下移植肿瘤的生长，而H22肝癌细胞致敏的DC对肿瘤的抑制程度更大，发挥特异性抗肿瘤作用。DC治疗组和DC-H22治疗组其抑瘤率分别为31.08%、68.30%，治疗后小鼠的进食情况、活动度等基本生命指标明显优于对照组，其存活期亦较盐水对照组延长。

本实验可以观察到DC及H22肝癌细胞致敏的DC治疗荷瘤小鼠后，无论是肿瘤体积还是生存期均有改善。但能否影响肿瘤的复发尚不确定，融合性后抗原递呈作用持续多久、抗肿瘤时间也不确定，可以发挥最大抗肿瘤作用的接种次数及间隔时间也还是未知数。本实验也经过DC及DC-H22治疗后复种H22肝癌细胞，但并未观察到无瘤生存现象，考虑与接种次数及间隔时间和小鼠的生存期短的干扰有关，需进一步实验研究。

DC的体外制备目前虽已较为成熟，但是如何增强其靶向性、特异性、持久性，仍是临床肿瘤治疗中一个艰巨的挑战。未来还需要针对肿瘤特殊的免疫抑制环境，整合 DC 疫苗以及其他的免疫治疗模式，形成更强大的肿瘤免疫治疗组合。

参考文献

[1]Friedl J,Stift A,Paolini P,etal.Tumor antigen pulsed dendritic cells enhance the cytolytic activity of tumor in filtrating lymphocytes in human hepatocellular cancer〔J〕.Cancer Biother Radiopharm,2000,15(5):477-486.

[2]H22荷瘤小鼠免疫功能状态的初步研究〔J〕.河北医学,2011,17(2):219-222.

[3]金娟,王保龙.RNA转染的树突状细胞疫苗及其在肿瘤治疗中的研究进展〔J〕.国际免疫学杂志，2010,33(1):53-55.

[4]张晓娟,董坚,吴振林,等.HSP70多肽复合物修饰DCs疫苗抗胰腺癌荷瘤小鼠的实验研究〔J〕.中国免疫学杂志,2009，25(9):792-796.

[5]张浩,郑树森, 蒋国平,等.小鼠肝癌树突状细胞融合瘤苗抗肿瘤作用的研究〔J〕.中华肝脏病杂志, 2004，12(11)：648-651.

(编辑雅文)

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收稿日期2015-09-04

中图分类号：R-332

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)24-3309-03