应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌进行同源性分析

闻海丰　秦瑾　于文静　冯彦蕊　冯忠军★

应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌进行同源性分析

闻海丰1秦瑾2于文静3冯彦蕊1冯忠军1★

［摘要］目的了解临床不同来源的鲍曼不动杆菌是否存在同源性，判断其是否存在耐药菌株的克隆播散，追踪其在医院交叉感染的可能途径，以便有效防控鲍曼不动杆菌在医院中传播。方法收集2012年10月至2013年6月临床分离的73株多重耐药鲍曼不动杆菌，用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）对菌株进行同源性分析。结果73株多重耐药鲍曼不动杆菌经ERIC-PCR分型分为8个基因型，分别用A、B、C、D、E、F、G、H表示，其中A型31株，B型15株，C型12株，D型8株，E型3株，F型2株，G和H型各为1株。A型为主要的流行株，分布在多个不同的科室。重症监护室（intensive care unit，ICU）分离的菌株存在6个基因型；骨科系统病区存在4个基因型；急诊科有5个基因型；内科发现有6个基因型；外科发现3个基因型。ICU病房环境物体表面共分离出4株鲍曼不动杆菌，其中9号和10号菌株来自于不同患者的床旁，12号和13号来自于护理站电脑键盘。结论临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌存在多个基因型。多重耐药鲍曼不动杆菌存在时间和空间的聚集性。

［关键词］鲍曼不动杆菌；多重耐药性；肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应；同源性

作者单位：1．河北医科大学第三医院检验科，河北，石家庄050051 2．河北医科大学第三医院感控科，河北，石家庄050051 3．河北省儿童医院检验科，河北，石家庄050031

Study on the homology of Acinetobacter baumannii by enterobacterial repetitive intergenic consensuspolymerase chain reaction

WEN Haifeng1, QIN Jin2, YU Wenjing3, FENG Yanrui1, FENG Zhongjun1★
(1. Department of Laboratory Medicine, The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei, China, 050051; 2. Department of Noscomical Infection Control, The Third Hospital of Hebei Medical University, Hebei, China, 050051; 3. Department of Laboratory Medicine, Chindren's Hospital of Hebei Procince, Hebei, China, 05005)

[ABSTRACT] Objective To investigate the homology of clinical isolated Acinetobacter baumannii and the epidemiology of the possible transmission routes.Methods73 isolates of non-repetitive multidrug resistant Acinetobacter baumannii were collected from October 2012 to June 2013. Epidemiological typing was performed by enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction (ERIC-PCR).Results The 73 isolates of Acinetobacter baumannii were classified into 8 distinct patterns by ERIC-PCR, including 31 of genotype A, 15 of genotype B, 12 of genotype C, 8 of genotype D, 3 of genotype E, 2 of genotype F, 1 of genotype G, and 1 of genotype H. Genotype A was the dominating clone and distributed in different wards. There were 6 genotypes in ICU unit, 4 genotypes in the department of orthopedics, 5 genotypes in emergency department, 6 genotypes in internal medicine and 3 genotypes in surgical department, respectively. There were 4 isolates of Acinetobacter baumannii on the surface of ICU unit. No. 9 and No. 10 isolates wereisolated from the bedsides of different patients, and No. 12 and No. 13 were isolated from the computer keyboard in nurses' station.ConclusionThe isolates of Acinetobacter baumannnii in our hospital have multiple genotypes. There were temporal and spatial aggregations in the infection of Acinetobacter baumannnii in our hospital.

[KEY WORDS] Acinetobacter baumannii; Multidrug resistant; ERIC-PCR; Homology

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，ABA）是一种非发酵革兰阴性球杆菌，具有较强的耐干燥能力，极易形成生物膜，可在医院环境中长期存活。鲍曼不动杆菌已经成为引起医院感染的重要病原菌，因此必须采取有效的消毒隔离措施，防止或减少鲍曼不动杆菌在医院环境中的定植和传播。本文采用分子分型方法检测不同来源的鲍曼不动杆菌的同源性，判断其是否存在耐药菌株的克隆播散，追踪其在医院交叉感染的可能途径，以便控制鲍曼不动杆菌在医院中传播。

1　材料与方法

1．1菌株来源

收集2012年10月至2013年6月河北医科大学第三医院临床标本中分离的鲍曼不动杆菌73株，排除同一患者住院期间检出的重复菌株，其中男50例，女19例；菌株来源主要为：痰液37株、伤口分泌物22株、血液5株、重症监护室（intensive care unit，ICU）环境表面分离4株，尿液、咽拭子、导管、腹水和脑脊液各1株（见表1）。全部菌株均符合多重耐药菌的标准，经ID32E鉴定试剂卡鉴定后，采用滤纸保存法，冻存于－80℃备用。

1．2主要试剂与仪器

肠杆菌科鉴定试剂盒（ID32E鉴定试剂卡）为梅里埃诊断产品（上海）有限公司产品，细菌基因组DNA提取试剂盒及DNA Marker为北京康为世纪生物科技有限公司提供，PCR扩增体系为加拿大富酶泰斯Fermentas公司产品。API7300型荧光定量PCR检测仪为美国应用生物系统公司Applied Biosystems产品，凝胶成像系统为美国Bio-rad公司提供。

1．3实验方法

1．3．1菌种复活及鉴定

将保存菌株的eppendorf管从－80℃冰箱中取出，平衡至室温后加入2 mL营养肉汤，35℃培养箱中孵育过夜，将菌悬液分区划线接种至哥伦比亚血琼脂培养基上，35℃培养18 h～24 h后，挑选3个～5个典型的单个菌落经ID32E鉴定试剂卡鉴定为鲍曼不动杆菌。

1．3．2抗菌药物敏感性实验

采用K-B琼脂纸片扩散法测定13种抗菌药物的敏感性，包括哌拉西林（piperacillin，PIP）、头孢他啶（ceftazidime，CAZ）、亚胺培南（imipenem，IPM）、头孢哌酮（cefoperazone，CFP）、头孢曲松（ceftriaxone，CRO）、庆大霉素（gentamicin，GM）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、阿米卡星（amikacin，AMK）、哌拉西林／他唑巴坦（piperacillin／tazobactam，TZP）、头孢吡肟（cefepime，FEP）、头孢哌酮／舒巴坦（cefoperazone／sulbactam，SCF）、左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）、甲氧苄啶／磺胺甲噁唑（trimethoprim／sulfamethoxazole，SXT）。根据美国实验室标准化研究所（clinicaland laboratory standards institute，CLSI）2012年版进行抗菌药物敏感性判断。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1．3．3细菌DNA模板的制备

严格按照细菌DNA提取试剂盒说明要求操作，提取实验菌株基因组DNA。

1．3．4引物的配制

根据文献查阅，合成ERIC-PCR引物［1－2］，把稀释引物至浓度为10 μM备用。引物序列为：ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGA TTCAC-3′；ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGT GAGCG-3′。

1．3．5同源性分析

采用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）对菌株进行同源性分析。

反应体系：ERIC1（10 μM）2 μL、ERIC2（10 μM）2 μL、DNA模板5 μL、水16 μL、Master Mix 25 μL，总反应体积为50 μL。PCR反应参数：95℃预变性60 s；95℃变性30s，52℃30 s，72℃60 s，进行35个循环；72℃最后延伸10 min。取5 μL扩增产物进行电泳，电压为110 V，电泳时间为45 min。电泳结束后用凝胶成像仪观察，并与DNA Marker进行对比。

1．3．6聚类分析

采用SPSS 13．0统计软件进行聚类分析，用1代表条带存在，用0代表条带不存在，各菌株条带数据收集起来组成原始数据矩阵，进行样本聚类分析，获得菌株间的亲缘性关系［3］。

2　结果

2．1鲍曼不动杆菌的药敏试验结果

73株多重耐药鲍曼不动杆菌除对头孢哌酮／舒巴坦耐药性较低（43．84%）外，对其它12种临床常用抗菌药物的耐药性普遍较强，其耐药率分别为：哌拉西林97．26%、头孢他啶95．89%、亚胺培南94．52%、头孢哌酮97．26%、头孢曲松95．89%、庆大霉素94．52%、环丙沙星95．89%、阿米卡星94．52%、哌拉西林／他唑巴坦95．89%、头孢吡肟95．89%、左氧氟沙星86．30%、甲氧苄啶／磺胺甲噁唑95．89%（见表2）。

表1　73株鲍曼不动杆菌标本来源Table 1　The sources of the specimen of 73 isolates

表2　73株鲍曼不动杆菌对13中抗生素药敏试验结果Table 2　The results of drug sensitivity test of 73 isolates of Acinetobacter baumannii

表3　鲍曼不动杆菌基因分型结果Table 3　The results of genotyping of isolates of Acinetobacter baumannii

M：Marker；A、B、C、D、E、F、G、H分别代表不同的基因型图1　ERIC-PCR基因分型结果Figure 1 The results of genotyping by using ERIC-PCR method

2．2 ERIC-PCR基因分型结果及菌株同源性分析

73株多重耐药鲍曼不动杆菌经ERIC-PCR反应，电泳条带长度在100～2 000 bp之间，根据电泳图谱差异进行同源性分析，73株菌株被分为8个基因型，用A、B、C、D、E、F、G、H表示（见图1，2）。其中A型31株，B型15株，C型12株，D型8株，E型3株，F型2株，G和H型各为1株。A型为主要的流行株，分布在多个不同的科室。ICU病房分离的菌株存在6个基因型，分别是A（10株）、B（7株）、C（5株）、D（5株）、F（1株）、G（1株）。骨科系统病区存在A（10株）、B（4株）、C（5株）、D （1株）4个基因型；急诊科有A（3株）、B（1株）、C （1株）、D（1株）、E（1株）5个基因型；内科系统病区发现有A型5株，B型3株，C、E、F、H各1株；外科系统病区发现A型3株，D、E各1株（见表3）。对ICU环境生物学物体表面监测，共分离出4株鲍曼不动杆菌，菌株编号分别为9（A型）、10（B型）、12（D型键盘）和13（B型键盘），其中9号和10号菌株来自于不同患者的床旁，12号和13号来自于护理站电脑键盘。

图2　73株鲍曼不动杆菌基因分型聚类分析Figure 2 Cluster analysis on 73 isolates of Acinetobacter baumannii

3　讨论

鲍曼不动杆菌是不动杆菌属中临床分离率最高的细菌，为非发酵、革兰阴性球杆菌，在自然界中分布广泛。近几年来，鲍曼不动杆菌被认为是与医院相关的机会性多重耐药病原菌［4－5］，主要引起呼吸机相关性肺炎、留置导尿管引起的尿路感染、中心静脉导管所致的血流感染和伤口感染，还可引起心内膜炎、骨髓炎和腹膜透析相关性感染。鲍曼不动杆菌造成的医院相关性感染通常与患者接受侵入性操作（如手术、机械通气、留置导管）和免疫功能低下有关。

为了探索鲍曼不动杆菌的流行特点和传播方式，国内外学者多对鲍曼不动杆菌进行分型和同源性分析。目前国内外常用的病原菌分子生物学水平的分型方法主要有脉冲场凝胶电泳（pulsedfield gel electrophoresis，PFGE）技术［6］、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）［7］和以PCR为基础的分型方法，包括随机引物PCR （random amplified polymorphic polymerase chain reaction，AP-PCR）［8］、重复序列PCR和扩增限制性片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）［9］等。重复序列PCR技术又分为基因外重复回文序列（repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction，REP-PCR）［10］和肠杆菌科基因间重复序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）［1］2种。PFGE通过对细菌的全部基因组DNA进行消化切割，将产物在动态变换角度的电场中电泳，依据消化产物的大小及构象不同而分离出指纹图谱进行分型。现今PFGE被国内外分子流行病学者普遍认同为病原菌分子生物分型的“金标准”方法。ERIC是由Sharples等［11］在大肠埃希菌中首先发现，在ERIC的中心有一段长约44 bp的保守性很强的反向重复序列，Versalovic［12］根据这一重复序列发展了ERIC-PCR技术。ERIC在不同种属甚至同一种的不同菌株之间的拷贝数和定位都不同，被用于细菌基因分型的研究。有研究表明ERIC-PCR与PFGE分型结果一致性非常高［13］，相对于PFGE分型方法，ERICPCR操作简便、实验周期短、结果可靠，更适合于大批量菌株的分类和鉴定。

本研究采用ERIC-PCR技术并通过同源性分析，将临床分离的73株鲍曼不动杆菌分为8个基因型，其中A型和B型为主要流行株，主要分布在ICU病房、急诊ICU病房和骨科病区。研究结果显示本院多重耐药鲍曼不动杆菌感染具有四个显著特点：（1）同一病房（病区）内存在多个基因型菌株同时流行，如ICU病房中就被检出A、B、C、D和G多个基因型；（2）同一病房（病区）内存在相同基因型的菌株传播流行。2012年11月在骨科a区的临床标本中分离出3株A型菌株，2013年1月急诊科共分离出7株菌，其中3株为A型，2013年3月在老年病病房分离出2株A型菌株，同一病区短时间集中出现相同菌株的感染，高度怀疑这些感染之间存在院内交叉感染；（3）不同病区内存在相同基因型的菌株同时传播流行。2012年11月分离的菌株中A型有8株，分别是ICU 2株、骨科a 区3株，骨科b区、骨科c区和外科某病区各1株；（4）在某一时间段出现多重耐药鲍曼不动杆菌集中暴发流行。2012年10月共分离出6株菌，2012年18株菌，2012年12月5株菌，2013年1 月14株菌，2013年2月1株菌，2013年3月9株菌，2013年4月6株菌，2013年5月4株菌，2013 年6月10株菌。可见在2012年11月至2013年1月分离出的鲍曼不动杆菌株数较多，虽然可能与气候寒冷、住院患者较多、部分患者病情较严重等原因有关，但是依然高度怀疑与医院病区清洁、消毒、隔离等工作存在疏漏导致院内感染增多有关。总体来说，多重耐药鲍曼不动杆菌在我院的感染和科室分布情况表现出了一定的时间和空间的聚集性。

鲍曼不动杆菌生存能力极强，能够在医院环境中长期存活。有研究［14］表明当感染的患者出院9天后，仍然能从患者病床上分离出鲍曼不动杆菌。另一研究［15］表明从干燥环境中分离的鲍曼不动杆菌的生存率高于从湿润环境中分离的菌株。鲍曼不动杆菌最常见的传播途径是接触传播，被鲍曼不动杆菌感染的病人（皮肤、体液）、器械和周围环境，甚至体内存在菌株定植的健康人群都可能成为鲍曼不动杆菌的传染源。本研究中，一名患者从ICU转到外科病区，之后在该患者的脑脊液中分离出与流行在ICU病房菌株基因型相同的鲍曼不动杆菌，推断该菌株可能在患者进行科室转换交接时未彻底清洁消毒而造成一定程度的传播。2012年11月对ICU病房环境进行细菌监测，共分离出4株鲍曼不动杆菌，菌株编号分别为9号（床旁）、10号（床旁）、12号（键盘）和13号（键盘）。其中9号菌株为A型，之后在ICU病房中又分离出多株与9号菌株基因型相同的菌株。12号菌株为D型，10号菌株、13号菌株和从这名患者的痰液标本中分离的菌株（7号菌株）均属于B型。2012 年12月至2013年1月，从ICU一名患者（25号菌株）的痰液中连续多次分离出基因型相同的菌株，均属于D型，表明当时ICU环境可能已经被同一株鲍曼不动杆菌污染。病房中的各种器械、设备，如心肺复苏机、呼吸机、吸痰器、输注泵、洗脸盆、床栏杆、床头桌、枕头、床垫、绷带和手推车等可能会被鲍曼不动杆菌污染，医护人员工作中经常触摸这些东西，很可通过污染的手将病原菌传播给患者，医护人员手和医疗设备是鲍曼不动杆菌传播的最主要媒介。本研究所分离的菌株主要分布在ICU病房、急诊科ICU病房和骨科病房，这些病区患者免疫力低下，多数接受过侵入性操作（如有创手术和气管插管等），也反映了鲍曼不动杆菌多通过接触途径在医院内流行传播。

我院在2012年10月到2013年6月分离的大多数鲍曼不动杆菌，除对头孢哌酮／舒巴坦的耐药率为43．83%，对其它抗菌药物的耐药率高达86．30%～97．26%。对几乎所有的临床常用药物耐药，包括对β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类等多类抗生素同时耐药，可见临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药情况严重。根据《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》和《多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南》，当感染的菌株表现为多重耐药时，其造成的感染将很难治疗。所以通过对医院内多重耐药鲍曼不动杆菌进行同源性分析，对其做流行病学调查和防控，不论是对于院感工作还是对于临床治疗工作都具有重要的意义和价值。鲍曼不动杆菌的耐药机制复杂且多种耐药机制共同发挥作用：产生β-内酰胺类水解酶、药物外排泵机制、膜孔道蛋白缺失或减少、青霉素结合蛋白（penicillin-binding protein，PBP）改变、表达氨基糖苷类修饰酶、对喹诺酮类药物作用靶位突变等［16］。由于鲍曼不动杆菌可以通过基因突变或获得外源性基因元件等方式获得耐药机制使其成为多重耐药菌株甚至全耐药菌株［16］，这就使得通过流行病学防控来阻断鲍曼不动杆菌菌株间耐药基因的传递可能比阻断院内感染发生显得更为重要。

参考文献

[1]Fouad M, Attia AS, Tawakkol WM, et al. Emergence ofcarbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii harboring the OXA-23 carbapenemase in intensive care units of Egyptian hospitals[J]. International Journal of Infectious Diseases, 2013,17(12):e1252-1254.

[2]Eser OK, Ergin A, Tunckanat F, et al. In vitro activity of tigecycline as a therapeutic option against multidrugresistant Acinetobacter spp[J]. The New Microbiologica, 2008,31(4):535-542.

[3]Ferreira AE, Marchetti DP, Cunha GR, et al. Molecular characterization of clinical multiresistant isolates of Acinetobacter spp. from hospitals in Porto Alegre, State of Rio Grande do Sul, Brazil[J]. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2011,44(6):725-730.

[4]Villegas MV, Hartstein AI. Acinetobacter outbreaks, 1977-2000[J]. Infect Control Hosp Epidemiol, 2003, 24(4):284-295.

[5]Peleg AY, Seifert H, Paterson DL. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen [J]. Clinical Microbiology Reviews, 2008,21(3):538-582.

[6]Abdalhamid B, Hassan H, Itbaileh A, et al. Characterization of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates in a tertiary care hospital in Saudi Arabia[J]. The New Microbiologica, 2014,37(1):65-73.

[7]Aly M, Tayeb HT, Al Johani SM, et al. Genetic diversity of OXA-51-like genes among multidrugresistant Acinetobacter baumannii in Riyadh,Saudi Arabia[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014,33(7): 1223-1228.

[8]Nowak J, Pacholczyk A, Petroniec V, et al. The results of molecular epidemiological investigations in patients infected with strains of the genus Acinetobacter [J]. Pneumonologiai Alergologia Polska, 2010,78 (6):386-391.

[9]Petersen K, Cannegieter SC, van der Reijden TJ, et al. Diversity and clinical impact of Acinetobacter baumannii colonization and infection at a military medical center[J]. Journal of clinical microbiology, 2011,49(1):159-166.

[10]Pasanen T, Koskela S, Mero S, et al. Rapid molecular characterization of Acinetobacter baumannii clones with rep-PCR and evaluation of carbapenemase genes by new multiplex PCR in hospital district of Helsinki and Uusimaa[J]. Plos One, 2014,9(1):e85854.

[11]Sharples GJ,Lloyd RG. A novel repeated DNA sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes[J]. Nucleic Acids Research, 1990,18(22): 6503-6508.

[12]Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J]. Nucleic Acids Research, 1991,19(24):6823-6831.

[13]孙晶,常军霞,刘巍. ERIC-PCR与PFGE检测铜绿假单胞菌同源性的方法学比较[J].中国抗生素杂志, 2013, 4(38):297-302.

[14]Catalano M, Quelle LS, Jeric PE, et al. Survival of Acinetobacter baumannii on bed rails during an outbreak and during sporadic cases [J]. The Journal of Hospital Infection, 1999,42(1):27-35.

[15]Wendt C, Dietze B, Dietz E, et al. Survival of Acinetobacter baumannii on dry surfaces[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1997,35(6):1394-1397.

[16]Roca I, Espinal P, Vila-Farres X, et al. The Acinetobacter baumannii oxymoron:commensal hospital dweller turned pan-drug-resistant menace[J]. Frontiers in Microbiology, 2012,3:148.

通讯作者：★冯忠军，E-mail：fz702＠sina．com

基金项目：河北省卫生厅重点科技研究计划（20110099）