乙醇注入法制备木犀草素脂质体

刘 菲，李 明，盛明明，阎雪莹

(黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040)

乙醇注入法制备木犀草素脂质体

刘 菲，李 明，盛明明，阎雪莹

(黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040)

探讨乙醇注入法制备木犀草素脂质体的制备工艺.采用乙醇注入法制备木犀草素脂质体，微柱离心和HPLC法测定包封率，激光粒度仪测定粒径.运用正交实验设计L9(34)优选最佳处方为：磷脂600 mg，药脂比1∶7，类酯比8∶1，有机相水相比1∶1，包封率79.3%，形态，稳定性良好.注入法制备木犀草素脂质体工艺简单，制得剂型稳定，方法可行.

木犀草素；脂质体；乙醇注入法；正交实验

木犀草素为一种黄酮类化合物，现多从植物白毛夏枯草，青兰中提取[1].近年来，其抗肿瘤活性越来越受到人们的重视，特别是其对肝癌的治疗作用.但由于其半衰期非常短，使得应用受到一定限制.脂质体作为一种新兴剂型，具有延缓药物释放的作用，并且对肝脏具有一定的靶向作用，因此将木犀草素包入脂质体中将会延长其半衰期并增加靶向性[2]，此外粒径在200 nm左右的脂质体在肝脾中停留时间明显延长[3]，从而增强了治疗作用.本文尝试采用乙醇注入法制备木犀草素脂质体.

1 仪器和试剂

LC-2010AHT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，HJ-6A型数显恒温多头磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，DELTA320PH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，Sartorius BT25S电子天平(德国Sartorius公司)，KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Zetasizer激光粒度仪(英国malvern公司).

大豆卵磷脂(上海太伟有限公司)，胆固醇(上海东尚实业有限公司)，木犀草素(95%，南京替斯艾莫研究所)，木犀草素对照品(中国生物制品研究所)，乙醇(天津市恒兴化学试剂有限公司)SephadexG-50(瑞典Pharmacia公司)，曲拉通X-100(Sigma公司).

2 方法与结果

2.1 标准曲线绘制

采用高效液相色谱法.精密量取木犀草素标准品1 mg，溶解于10 mL容量瓶中，配制100 μg/mL的溶液待用.精密量取溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.3、1.6、3.2 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容到刻度，配成4.0、10、16、20、26、32、64 μg/mL的标准液.每次进样10 μL，以对照品峰面积为Y轴，对照品质量浓度为X轴，绘制标准曲线.从图1可见，木犀草素在1.0～32 μg/mL范围内线性良好.

图1 木犀草素标准曲线图

2.2 脂质体的制备

滴管吸取适量溶于乙醇的磷脂、胆固醇，以缓慢速度滴于适量PBS中，滴定过程将尖端插入液面以下，同时搅拌子高速旋转.滴定结束后直到所形成的溶液无有机溶剂味道停止加热和搅拌，得到的混悬液即为脂质体溶液[4-5].

2.3 包封率的测定

2.3.1微柱离心分离脂质体的方法考察

SephadexG-50凝胶粉末放入蒸馏水中煮沸2 h，使其充分溶胀，加入PBS(pH=7.4)，抽出其中气泡备用.取2 mL注射器外壳，底部铺薄层脱脂棉，装入凝胶，使其静止高度达到2.3 mL[6].

取0.15 mL脂质体样品上样微型柱，将微型柱放入5 mL离心管中，以4 000 r/min，离心3 min，取离心后液体，加10%曲拉通X-100乙醇液适量破乳，定容10 mL.离心后的微型柱每次加3 mLPBS，重复取样15次，经HPLC检测，离心6次后，脂质体样品中的木犀草素检测不到，因此确定微柱离心的次数为6次.

2.3.2包封率的测定

取脂质体样品0.15 mL上样，每次离心后加3 mLPBS，收集前6次离心液放入刻度试管，加2 mL10%曲拉通X-100乙醇溶液充分震荡进行破乳，甲醇定容10 mL，HPLC测定，记录峰面积①.另取脂质体1.5 mL，甲醇定容至10 mL，HPLC测定，记录峰面积②，包封率=①/②*100%.

2.4 优选最佳工艺

2.4.1单因素考察

1)滴速 固定其他因素，以30、60、90、120 滴/min的滴速滴于缓冲液中，制备脂质体.得到的包封率分别为68.2%、70.1%、71.7%、69.4% .滴速对脂质体包封率几乎无影响，慢滴速虽然在滴入后的状态很好，但由于处在高温状态，很难保证磷脂的被氧化.而高滴速滴入的状态不是很好，因此选择60 滴/min为宜.

2)温度 固定其他因素，以45、50、55、60、65 ℃的温度制备脂质体，得到的包封率分别为67.6%、65.3%、69.4%、68.8%、70.3%.结果相差不多，说明温度对脂质体包封率影响不大.高于磷脂相转变的温度对脂质体包封率几乎无影响，但低温度乙醇挥发太慢，不利于注入法制备脂质体，而高温度会加速脂质体的氧化，因此选择一个合适的温度范围，对制备脂质体尤为重要.

3)磷脂用量 固定其他因素，分别以300、400、500、600、700、800 mg的磷脂质量制备脂质体，得到的包封率分别为50.3%，65.5%，66.7%，69.3%，72.3%，72.5%.磷脂量对包封率有影响，随着磷脂用量的增加包封率加大.300～600 mg质量的磷脂都能制备出状态良好的脂质体，但600～800 mg的磷脂包封率已无太大区别，因此考虑经济因素正交实验选择400、500、600 mg.

4)磷脂胆固醇质量比 固定其他因素，以6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、12∶1的类酯比制备脂质体，得到脂质体包封率分别为72.6%、73.4%、68.9%、65.3%、64.2%、62.1%.说明类酯比对包封率有影响，磷脂胆固醇比在7∶1时，包封率最高.

5)药脂比 固定其他因素，选择药脂比1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10制备脂质体，得到脂质体包封率分别为72.3%、71.8%、62.4%、62.1%、60.1%、60.5%.说明药脂比对包封率有影响，当药脂比在1∶5时包封率最高，随着药脂比增加，包封率降低.

6)有机相和水相比 以乙醇和缓冲液的体积比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3制备脂质体，固定其他因素，得到的包封率分别为66.3%，68.7%，63.3%，52.3%，54.1%.说明有机相，水相比影响包封率，当有机相和水相比为2∶1时包封率最高.

2.4.2正交实验设计

根据上述单因素考察结果，设计正交实验.因素水平表及正交实验结果参见表1、2.

表1 因素-水平表

因素水平1231．(磷脂用量)4005006002．(类脂比)6∶18∶110∶13．(药脂比)1∶51∶71∶94．(油水比)2∶11∶11∶2

表2 木犀草素脂质体正交设计结果(n=3)

A(磷脂)B(PC：ChO)C(药脂比)D(油水比)包封率/%1111166．32122271．83133369．84212361．05223170．76231268．77313279．38321362．79332177．6Ij69．368．965．971．5IIj66．868．470．173．3IIIj73．272．073．364．5R6．43．67．48．8

采用直观分析法分析,结果表明,各因素对包封率的影响程度为: D>C>A>B.最佳组合为A3B1C3D2，即磷脂用量600 mg、磷脂与胆固醇的比例为6∶1、药脂比1∶9、油水比1∶1.

2.5 最佳工艺验证

精密称量磷脂600 mg，胆固醇100 mg，木犀草素67 mg，乙醇和PBS各20 mL，按2.2项下方法制备脂质体，五次测量结果见表3.

表3 五次测量结果

12345平均值包封率/%79．378．576．880．677．878．6±1．45

2.6 粒度测定

将脂质体样品稀释若干倍，以Zetasizer 激光粒度仪测量粒径，见图2，粒径平均分布在206 nm左右.

图2 木犀草素脂质体粒径分布示意图

3 讨 论

本研究确定了乙醇注入法制备木犀草素脂质体的方法.首先通过对滴速、温度、磷脂用量、磷脂胆固醇质量比、药脂比和有机相与水相比进行单因素考察，得到的结果60 滴/min的滴速为宜、温度对脂质体包封率影响不大、随着磷脂用量的增加脂质体的包封率增大、磷脂胆固醇质量比7∶1和药脂比在1∶5时包封率最高，同时有机相与水相比也会影响包封率，当有机相和水相比为2∶1时包封率最高.然后根据单因素考察结果，设计正交实验，确定最佳组合为磷脂用量600 mg、磷脂与胆固醇的比例为6∶1、药脂比1∶9、油水比1∶1.最后本实验对此最佳制备工艺的验证表明包封率均在80%左右稳定保持稳定，并且粒径保持在200 nm.

[1] 张芳芳, 沈汉明, 朱新强. 木犀草素抗肿瘤作用的研究进展[J]. 浙江大学学报, 2006, 35(5): 573.

[2] 黄 杰, 仵文英. 脂质体制剂抗肿瘤应用及进展[J]. 西部药学, 2007, 4(3): 158

[3] NAGAYASU A, UCHIYAMA K, KIWADA H. The size of liposomes: a factor which affects their targeting efficiency to tumors and therapeuticactivity of liposomal antitum or drugs [J]. Advanced Drug Deliver Reviews, 1999, 40 (1-2): 75-77.

[4] 邓英杰. 脂质体[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2007.

[5] ZUIDAM N J, DE VREH R, CROMMELIN D J A. Characterization of liposomes [M]. New York: OxfordUniv Press, 2003.

[6] 秦 晶, 陈大为, 乔明曦, 等. 微柱离心法测定阿魏酸脂质体包封率[J]. 中国药学杂志, 2007，42(14): 1116-1117.

Preparation of luteolin liposome by ethanol injection

LIU Fei, LI Ming, SHENG Ming-ming, YAN Xue-ying

(School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040)

To investigate the preparation of ethanol injection of luteolin liposome, the liposome was prepared by ethanol injection. Entrapment rate was measured by microcolumn offcenter and HPLC. The particle size of luteolin liposome was measured by using the laser particle size analyzer. Orthognal test L9(34)was applied to choose the best method, and the result was as follows: PC (600 mg), PC∶Cho (6∶1), cho∶PC (1∶9), ethanol∶PBS (1∶1), entrapment rate of 79.3%. The shape and stability were good. The method of ethanol injection of luteolin liposome was easy, and the dosage was stable. So this method could be applied in luteolin liposome preparation.

luteolin; liposome; ethanol injection; orthogonal test

2014-04-29.

刘 菲(1988-)，女，硕士，研究方向：缓控释制剂.

阎雪莹(1971-)，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：缓控释制剂.

TQ461

A

1672-0946(2015)05-0540-03