RP-HPLC法测定北五味子中6种木脂素类成分

吴 伦，苏 阳，范海潮，刘 杰，田振坤

(1. 黑龙江中医药大学 中医药研究院，哈尔滨150040；2. 黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨150040；3. 宜康(杭州)生物技术有限公司，杭州 310011)

RP-HPLC法测定北五味子中6种木脂素类成分

吴 伦1，苏 阳2，范海潮3，刘 杰1，田振坤1

(1. 黑龙江中医药大学 中医药研究院，哈尔滨150040；2. 黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨150040；3. 宜康(杭州)生物技术有限公司，杭州 310011)

采用RP-HPLC法同时测定北五味子中6种木脂素类成分.色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6×150 mm)，流动相为甲醇-水溶液梯度洗脱，检测波长为254 nm，柱温为25 ℃.结果表明：五味子甲素在40.4～600.0 μg/mL(r=0.999 8)、五味子乙素在42.0～420.0 μg/mL(r=0.999 9)、五味子丙素在15.8～118.8 μg/mL(r=0.999 5)、五味子醇甲在10.0～160.0 μg/mL(r=0.999 9)、五味子醇乙在15.5～388.0 μg/mL(r=0.999 5)、五味子酯甲在16.3～408.0 μg/mL(r=0.999 9)范围内峰面积与对照品质量浓度呈良好的线性关系(n=6).6种成分的加样回收率均高于98%，RSD值小于3%本方法简便，准确，快速，重现性好，可用于北五味子中有效成分的定量分析.

北五味子；木脂素；高效液相色谱法；含量测定

北五味子系木兰科植物五味子的成熟干燥果实，具有益气生津、收敛固涩、补肾宁心之功效，临床上常用于津伤口渴、久嗽虚喘及心悸失眠等症[1-2].自然分布黑龙江省小兴安岭、完达山、张广才岭、老爷岭等山区，清河林区位于小兴安岭南麓，松花江中游北岸，地理位置得天独厚，为五味子种植提供了良好生长环境.为了更好地控制与鉴别北五味子质量，以产自清河林区北五味子为研究对象，研究北五味子中木脂素类化学成分，该方法排除了样品中杂质成分的干扰，能够较好地对指标组分进行准确定量.本文针对北五味子中六种木脂素成分进行含量测定，为北五味子药材的质量控制与开发利用提供科学依据.

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(四元泵G1311C、紫外检测器G1314B)，Agilent公司；旋转蒸发器(东京理化器械株式会社)；MS205DU型电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司).五味子药材(清河林业局育林林场)；五味子醇乙、五味子醇甲、五味子乙素、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素(中国食品药品检定研究院)；甲醇色谱纯(Dik-ma公司)；甲醇(西陇化工股份有限公司)；其他试剂均为分析纯.

1.2 供试品溶液制备

称取药材适量，粉碎，过60目筛，于60 ℃下干燥至恒重.精密称取干燥的五味子粉末2.01 g，加入85%乙醇40 mL回流提取3次，3 h/次，过滤，减压干燥后加甲醇定容至25mL容量瓶中，得供试品溶液.

1.3 对照品溶液制备

分别精密称取6种对照品适量，分别用甲醇定容置25 mL容量瓶中，制得质量浓度分别为200、1 552、

1 632、4 040、4 200、1 584 μg/mL的对照品溶液.

1.4 液相色谱条件[3-4]

比较多种洗脱梯度，确定最佳色谱条件是色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6×150 mm).流动相：A：水、B：甲醇，梯度洗脱：0～20 min 50%B→55%B；20～30 min 55%B→58%B；30～60 min 58%B→70%B；60～80 min 70%B→79%B；80～90 min 79%B→83%B；90～100 min 83%B→100%B；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL.洗脱梯度出峰数目多，且峰形对称、分离度好.

图1 北五味子对照品HPLC色谱图

图2 北五味子HPLC色谱图

2 方法学验证

2.1 线性关系考察

分别精密量取6种对照品储备液，置于10 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度[5-8].体积和对照品质量浓度见表1，按“1.4项下”色谱条件测定，分别进样20 μL，记录色谱峰面积.以北五味子各对照品质量浓度C(μg/mL)为横坐标，峰面积S值为纵坐标进行线性回归，结果见表2.

表1 各对照品体积、质量浓度和峰面积值

对照品123456五味子醇甲体积/mL0．51．02．04．06．08．0质量浓度/(μg·mL-1)10．020．040．080．0120．0160．0峰面积3196651290256139315194五味子醇乙体积/mL0．10．41．01．51．82．5质量浓度/(μg·mL-1)15．562．1155．2232．8279．4388．0峰面积2389002081313137265423五味子酯甲体积/mL0．10．250．51．01．52．5质量浓度/(μg·mL-1)16．340．881．6163．2244．8408．0峰面积3597991638318547547800

续表

对照品123456五味子甲素体积/mL0．10．20．30．41．01．5质量浓度/(μg·mL-1)40．480．8121．2161．6404．0600．0峰面积11892506349247951292219177五味子乙素体积/mL0．10．140．20．30．41．0质量浓度/(μg·mL-1)42．058．884．0126．0168．0420．0峰面积1044168523093467465411864五味子丙素体积/mL0．10．250．350．450．50．75质量浓度/(μg·mL-1)15．839．655．471．379．2118．8峰面积3239261426184721323185

表2 北五味子木脂素线性回归方程

对照品方程R范围/(μg·mL-1)五味子醇甲Y=32．531X-4．74930．999910．0～160．0五味子醇乙Y=13．705X-4．71250．999215．5～388．0五味子酯甲Y=19．041X+59．4940．999916．3～408．0五味子甲素Y=32．39X-254．050．999840．4～600．0五味子乙素Y=28．43X-88．2990．999942．0～420．0五味子丙素Y=28．1X-140．320．999515．8～118．8

2.2 精密度实验

分别取6种对照品溶液各0.5 mL，置于10 mL容量瓶中用甲醇稀释至刻度.按“1.4项下”色谱条件进样20 μL连续进样六次，记录6种木脂素对照品峰面积，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的RSD分别为0.4%、0.5%、0.3%、0.5%、0.6%、0.9%，表明仪器精密度良好.

2.3 稳定性实验

分别取6种对照品溶液各0.5 mL，置于10 mL容量瓶中用甲醇稀释至刻度.分别于0、1、2、4、8、12、24 h进样20 μL，记录峰面积.五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的RSD分别为0.3%、0.3%、0.6%、0.5%、0.4%、0.7%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好.

2.4 重现性实验

取同批次药材粉末6份，照“1.2项下”方法平行制备样品溶液并依法测定，结果：五味子醇甲RSD为0.8%、五味子醇乙RSD为0.5%、五味子酯甲RSD为0.9%、五味子甲素RSD为0.6%、五味子乙素RSD为0.7%、五味子丙素的RSD为0.8%，表明该方法的重现性良好.

2.5 加样回收率实验

精密称取上述已知质量分数同批次药材两份，分别加入6种对照品溶液适量按“1.2项下”方法配制十份，在“1.4项下”色谱条件下进样20 μL，计算各组分回收率.结果：五味子醇甲平均回收率98.7%(RSD为1.8%)、五味子醇乙平均回收率101.4%(RSD为1.3%)、五味子酯甲平均回收率99.7%(RSD为2.1%)、五味子甲素平均回收率98.3%(RSD为1.7%)、五味子乙素平均回收率102.5%(RSD为1.6%)、五味子丙素平均回收率103.1%(RSD为2.2%).结果表明，该处理方法对6种对照品具有较高的回收率.

2.6 百分含量测定

取同一产区5批北五味子药材，按照“1.2项下”方法制备供试品溶液，在“1.4项下”色谱条件进样20 μL测定3次，记录6种木脂素对照品色谱峰面积，计算各组分百分含量，结果见表3.

表3 同一产区5批北五味子各木脂素百分含量变化(%)

样品五味子醇甲五味子醇乙五味子酯甲五味子甲素五味子乙素五味子丙素总木脂素10．80430．38940．13020．17220．31560．03931．851020．81010．35740．09550．15300．33740．05101．804430．78770．38000．12140．14770．30000．04951．789940．77100．48920．09550．15270．44100．07952．028550．85370．44830．09360．24270．47790．13172．1575

3 结 语

东北道地药材北五味子作为临床常用中药，主要来源于野生资源，由于森林面积的减少及五味子果实的掠夺性开采，致使北五味子的产量逐年减少，现今采用人工大面积种植北五味子，但质量不均影响北五味子的开发利用，因此建立简便有效的质量控制方法必不可少.

本实验建立了RP-HPLC测定北五味子中6种木脂素含量测定方法.该法具有快速、准确、灵敏度高、重现性好等特点，可用于北五味子中有效成分的定量分析，为北五味子的开发利用提供依据.运用该方法对清河林区北五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和五味子酯甲含量进行了测定，结果表明该地区北五味子中6种木脂素类成分含量较高，证实清河林区为北五味子种植提供了良好的生长环境.

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Simultaneous determination of content of 6 kinds of lignans in Fructus schisandrae chinensis by RP-HPLC

WU Lun1, SU Yang2, FAN Hai-chao3, LIU Jie1, TIAN Zhen-kun1

(1. Research Institute of Traditional Chinese Medicine， Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2. School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040, China; 3. Abcam (Hangzhou)Biotechnology Co., Ltd, Hangzhou 310011, China)

In this paper, RP-HPLC to simultaneously determine 6 kinds of lignans in fructus schisandrae chinensis was adopted. The column was Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm, 4.6×150 mm). The mobile phase was consisted of methanol-water solution(gradient elution). The detect wavelength was set at 254 nm, and the column temperature was 25 ℃. Results indicated that deoxyschizandrin at the range of 40.4～600.0 μg/mL (r=0.999 8),γ-Schisandrin at the range of 42.0～420.0 μg/mL (r=0.999 9), Schisandrin C at the range of 15.8～118.8 μg/mL (r=0.999 5), Schisandrin at the range of 10.0～160.0 μg/mL (r=0.999 9), Schisandrol at the range of 15.5～388.0 μg/mL (r=0.999 5) Schisantherin A at the range of 16.3～408.0 μg/mL (r=0.999 9) have good linear relationship between peak area and concentration of

ubstance (n=6). The sample recovery rate of 6 kinds of ingredients was higher than 98%, and theRSDvalue was less than 3%. This method was simple, accurate, celerity and good reproducibility, and can be used for quantitative analysis of effective ingredients of fructus schisandrae chinensis.

fructus schisandrae chinensis; lignans; RP-HPLC; content determination

2014-07-17.

吴 伦(1983-)，男，博士，助理研究员，研究方向：中药创新药物研究

田振坤(1955-)，男，教授，博士生导师，研究方向：中药创新药物研究.

R284

A

1672-0946(2015)05-0536-04