RP-HPLC 纯化碱性疏水肽的条件优化

陆 旋

（浙江经贸职业技术学院应用工程系，浙江 杭州 310018）

随着现代生物技术的发展，出现了各种多肽类药物，多肽在临床医学中有巨大的应用价值。自从发明固相法化学合成多肽以来，有关各种活性多肽的化学合成有了很大发展[1]。多肽是由蛋白质中20 种氨基酸以不同组成和排列方式通过肽键（也称酰胺键）相互连接形成的化合物的总称[2]。本实验所用为较为复杂的12 肽。从现代分离科学理论得出，色谱和电泳是目前所知的分离效果最佳的两种方法。电泳仅能用于分离而不能用于多肽的制备[3]。本实验所用为反相高效液相色谱法。反相高效液相色谱（RP-HPLC）是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂或其水溶液作为流动相，根据溶质疏水性的差别进行分离纯化的洗脱色谱法[4]。RP-HPLC 主要用于分子量低于5000 的多肽的分离纯化，因其具有分离效果好、分辨率高、重复性好、分析速度快等优点。因此，RP-HPLC 是目前分离纯化和制备多肽的主要手段[5]。本文拟用RP-HPLC 对化学合成的碱性疏水12 肽进行分离、纯化和制备。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 多肽

合成的碱性疏水12 肽粗品由杭州中肽生化有限公司提供。其氨基酸序列如下所示：碱性疏水12 肽：Ala-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Pro-Ala-Thr-Gly-Gly-Lys（Biotion）。

1.1.2 试剂

制备级色谱乙腈；分析级色谱乙腈；三氟乙酸（TFA）（美国Sigma 公司）；纯化水（哇哈哈有限公司桶装20 L）；流动相A 液[水+0.1% TFA（V/V/%）]；流动相B 液[乙腈+0.1%TFA（V/V/%）]。

1.2 仪器与设备

仪器：三角瓶、离心管、液氮瓶、搅拌棒、废液瓶、药匙。

设备：瓦里安HPLC 高效液相色谱仪（长春博盛量子科技有限公司）、GLP-ID 25.4×450 mm C18100A 10um 制备色谱柱（成都格莱精密仪器有限公司）、Luna 5u C18（2）150×4.60 mm 5 micron 分析色谱柱（成都格莱精密仪器有限公司）、KH-300型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）、FA20043 万分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）、TWT2003H 千分之一天平（杭州万泰天华仪器有限公司）、冷冻干燥机FD-1A-50（北京博医康实验仪器有限公司）、GPDG-25 进口冻干机、HEWLETT SERIES// PACKARD 1090 Liquid Chromatograph。

1.3 实验方法

1.3.1 多肽溶解

将装在离心管里的碱性疏水12 肽固体用药匙取适量放于烧杯中，碾成粉末，加入乙腈和水（7:3），将烧杯放于超声波仪器中进行搅拌溶解，直至溶液变得澄清透明。将溶解完的液体用循环水式真空泵过滤，收集并备用。

1.3.2 仪器处理准备

以100%流动相A 液冲洗RPLC 色谱柱8 min，然后进行线性梯度洗脱直至达到要求的B 液浓度[乙腈+0.1% TFA（V/V/%）]。

1.3.3 上样

将B 泵放入溶解完的多肽中，设置A、B 泵流速为各50%进行上样，上样中要多次少量的加溶剂使多肽完全进入仪器中，上完样停泵，设置合适的梯度进行走样。本实验分别对梯度方式，进样量进行条件优化，比较分析所得结果。

1.3.3.1 梯度方式的优化实验

以碱性疏水12 肽作为粗品，在其他实验条件不变的情况下，选择不同的梯度方式，进行单因素试验，以寻找出在纯化过程中最合适的线性梯度。线性梯度模式见表1。

1.3.3.2 进样量

以碱性疏水12 肽作为粗品，在其他实验条件不变的情况下，选择不同的进样量，进行单因素试验，以寻找出在纯化过程中最合适的进样量，使最后的收集量最大化。进样量改变见表2。

表2 不同进样量

1.3.4 样品的收集

根据峰型收集各色谱馏分，保留并进行检测。

1.3.5 仪器处理

收集完样品后，用100 % B 液洗脱10 min，使残余在柱上的物质完全冲洗下来,然后再用相应浓度的A 液平衡色谱柱，以构成一个完整的色谱过程。流速1.0 mL/min，碱性疏水12 肽的检测波长为220 nm。

2 结果与讨论

2.1 RP-HPLC 对碱性疏水肽粗制品分析结果

以乙腈作为流动相，用RP-HPLC 对碱性疏水12 肽的粗品进行分析。图1 为碱性疏水12 肽粗品的分析图。

由图1 可见，图中出现了明显的5 个峰，目标峰为11.004 时出现的峰，峰的吸收不高，有很多杂峰，证明粗品的纯度低，由图可知，纯度只有57.4%。粗品主峰附近有小峰，较难分离。

图1 碱性疏水12 肽粗品的分析检测图

2.2 改变梯度方式对碱性疏水肽分离纯化结果

图2 30%→60%B 梯度RP-HPLC 色谱分离图

图2 为30%→60%B 梯度下的色谱分离图，由图可知目标峰为色谱峰8，即含有所要收集的样品，各小峰为分离出来的杂质，色谱峰9、10、11为洗脱出来的无效峰，保留色谱峰8，用于检测。

图3 色谱峰8 的分析检测图

图4 20%→40%B 梯度的RP-HPLC 色谱分离图

图3 为色谱峰8 的分析检测图，由图中可见在30%→60%B 梯度下收集的目标峰检测结果为79.77%，纯度与粗品相比有所提高，但效果不明显。

由图4 可见，在20%→40%B 梯度下的色谱分离图，由图可知目标峰为色谱峰3，即含有所要收集的样品，各小峰为分离出来的杂质，保留色谱峰3，用于检测。

图5 色谱峰3 的分析检测图

图5 为色谱峰3 的分析检测图，由图中可见在20%→40%B 梯度下收集的目标峰检测结果为82.09%，纯度与粗品相比大有提高，与30%→60%B 梯度下收集的目标峰检测相比也有所提高，但未达到目标要求95%的纯度。

图6 25%→35%B 梯度的RP-HPLC 色谱分离图

图6 为25%→35%B 梯度下的色谱分离图，由图可知目标峰为色谱峰3，即含有所要收集的样品，各小峰为分离出来的杂质，保留色谱峰3，用于检测。

图7 色谱峰3 的分析检测图

图7 为色谱峰3 的分析检测图，由图中可见在25%→35%B 梯度下收集的目标峰检测结果为96.62%，纯度与粗品相比大有提高，与30%→60%B 和20%→40%B 梯度下收集的目标峰检测相比也大有提高，且纯度超过所要求纯度95%。

2.3 改变进样量对碱性疏水肽分离纯化后成品效率的结果

由表3 可见进样量80 mg 到150 mg 逐渐增加的过程中，其纯化后成品的效率也不断提升，当进样量超过150 mg 达到160 mg 时，其纯化后成品的效率反而降低，在进样的过程中，应选用150 mg。

表3 不同进样量的效率

3 结论

本文主要从纯化过程中的进样量以及梯度方式两个方面对碱性疏水12 肽的反相高效液相色谱进行条件优化，最后选择线性梯度为25%→35%B，以150 mg 为进样量，作为最佳纯化条件。在该优化条件下，可收集目标峰检测纯度为96.62%的碱性疏水12 肽，此结果不仅达到目标要求，而且成品收集效率可高达80%。

[1]袁庆龙，候文义.Ni-P 合金镀层组织形貌及显微硬度研究[J].太原理工大学学报，2001，32（1）：51-53.

[2]李医明.多肽类PPLC 纯化法[J].生物化学与生物物理学报，2000，3（4）：351-355.

[3]张艳华，李影，巨芳，等.高效液相色谱分离纯化多肽的研究进展[J].中国食物与营养，2009，9：34-36.

[4]Smith D D，Saha S，Fang G，et al.Modifications to the N—terminus but not the C-terminus of calcitonin generelated peptide（8-37）produce antagonists with increased affinity[J].Med Chem，2003，46（12）：2427-2435.

[5]郝志芳.利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析和制备多肽[D].常州工程职业技术学院，2009:1-19.