白细胞介素-17对人黑素细胞合成黑素功能的影响

杨莉莉，隗祎，杨骥，李明

（1．上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021；2．复旦大学附属中山医院，上海 200032）

Th17 是近年来新发现的CD4+T 辅助细胞（T helper，Th）亚群，通过分泌细胞因子白细胞介素（IL-17）参与了系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎、多发性硬化等多种自身免疫性疾病的发生和发展[1]。白癜风作为一种临床常见的色素脱失性皮肤病，近年来有越来越多证据支持T 细胞免疫紊乱是

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品 人黑素原代细胞，从小儿包皮中分离，进行原代培养，纯化后获得，使用第2 代或第3代的细胞进行实验。本实验所用小儿包皮全部来源于泌尿外科小儿包皮环切术后遗弃之包皮标本，小儿年龄<10 岁，无白癜风病史或家族史，所有用于研究的标本均获得家属知情同意。

1.1.2 主要试剂 黑素细胞培养液Medium254 及生长因子HMGS 均购自美国Invitrogen 公司。Triton X-100 PrimeScript RT 逆转录试剂盒及SYBR green荧光定量PCR 试剂盒均购自日本TAKARA 公司。重组人IL-17A 细胞因子购自美国R&D 公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司。荧光定量PCR 检测系统及酶标仪为美国Bio-Rad 品牌。细胞培养箱为德国Heraeus 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 人黑素细胞原代培养 取小儿包皮环切术后遗弃的包皮组织，用含青链双抗的D-Hank′s 液反复冲洗，眼科剪减去皮下组织及部分真皮，并修剪成2 mm×10 mm 的小条，置无菌瓶中，0.2%分离酶4 ℃消化过夜。弃去消化液，冲洗，眼科镊轻轻分离真表皮，将表皮放入新的培养皿中并剪碎，加入0.25%的胰酶-EDTA 继续消化10 min。终止消化，吸管轻轻吹打成细胞悬液，离心，重悬，细胞计数，按5×105/mL 密度接种于25 cm2培养瓶，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养。2～3 d 换液1 次。原代细胞长满80%时，以0.25%的胰酶-EDTA 消化传代，第二代接种时采用胰酶差别消化法去除角质形成细胞。实验选用第2、3 代黑素细胞。

1.2.2 酪氨酸酶活性检测 将细胞浓度为3×104个/mL 的黑素细胞悬液按每孔100 μL 接种于96 孔培养板，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，吸弃培养液，用含0，100，200，400 ng/mL IL-17A 的新鲜培养液换液1 次，每种浓度设3 复孔。48 h 后，弃上清液，以PBS 洗1 次，每孔加1%的Triton X-100 溶液90 μL，迅速置-80 ℃冻存30 min，之后室温下融化使细胞完全破裂。加入0.1%L-DOPA 溶液100 μL/孔，37 ℃水浴箱中反应2 h。于酶标仪490 nm 波长处测定每孔吸光度。酪氨酸酶活性以[药物处理组A490/空白对照组A490×100%]表示。

1.2.3 黑素含量检测 将黑素细胞接种于6 孔板，每孔5×104个细胞，细胞接种24 h 后，分别用含0，100，200，400 ng/mL IL-17A 的新鲜培养液换液1次。48 h 后，去上清，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1 次，每孔加500 μL 浓度为1 mol/L 的NaOH，置70 ℃水浴2 h 以溶解黑素。将6 孔板中的裂解液转移至96孔板，每孔100 μL，设3 个复孔，置酶标仪于562 nm波长处检测吸光度值。用BCA 蛋白浓度检测试剂盒绘制蛋白浓度标准曲线，计算各给药孔黑素含量。黑素含量以[药物处理组A562/空白对照组A562×100%]表示。

1.2.4 荧光定量PCR 将黑素细胞接种于6 孔板，每孔5×104个细胞，细胞接种24 h 后，分别用400 ng/mL 浓度IL-17A 的新鲜培养液换液1 次。48 h后，去上清，用Trizol、氯仿和异丙醇提取黑素细胞RNA，反转录，最后行荧光定量PCR。表1 为本实验所用引物，均由上海生工生物工程公司合成，实验步骤参照TAKARA 公司Triton X-100 PrimeScript RT 逆转录试剂盒及SYBR green 荧光定量PCR 试剂盒说明书进行。见表1。

表1 荧光定量PCR 实验使用引物

1.2.5 流式细胞仪测定黑素细胞凋亡率 收集400 ng/mL 浓度IL-17A 作用48 h 后的黑素细胞，冷PBS 洗涤1 次，以1 000 转/min 离心5 min，弃上清，重悬细胞于100 μL 的标记缓冲液中，调整细胞密度为2×105个/mL；每管分别加入Annexin V 溶液和PI 溶液，混匀后于室温下避光孵育15 min。最后补Annexin Binding Buffer 至400 μL，以流式细胞仪检测细胞凋亡比例。每个样品检测1 万个细胞，用Flowjo 7.6 软件进行细胞凋亡率分析。

1.3 统计学分析 定量资料采用均数±标准差表示，通过单因素方差分析ANOVA 或非参数检验进行组间比较。所有统计分析都在SPSS 15.0 for windows 统计软件中进行。P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黑素细胞原代培养 使用商品化的添加HMGS 的M254 培养液和分离酶-胰酶两步消化法能从小儿包皮中得到大量高纯度的原代黑素细胞，细胞在10 d 左右达到完全纯化并显示出旺盛的增殖活性。原代培养10 d 的黑素细胞，镜下见黑素细胞为树突状细胞，大多数细胞有2～3 级树突，胞体内可见黑素颗粒，细胞增殖良好，连接成网，细胞铺满培养瓶后进行传代培养，约7～10 d 传一代。经Mart-1 单抗免疫细胞化学染色鉴定为纯化的黑素细胞，见图1。

图1 原代培养并纯化的人黑素细胞

2.2 IL-17A 对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成量的影响 中、高浓度的IL-17A 对酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用（P<0.05），且呈浓度依赖性。中、高浓度的IL-17A 对黑素合成量具有一定抑制作用（P<0.05），且呈浓度依赖性。见表2。

表2 IL-17 对人黑素细胞酪氨酸酶活性、黑素合成量的影响

2.3 高浓度IL-17A 对黑素合成关键基因mRNA表达的影响 将400 ng/mL 的IL-17A 作用黑素细胞48 h，收集黑素细胞并提取总mRNA，常规逆转录后，行荧光定量PCR 检测mRNA 表达。结果显示，400 ng/mL 浓度的IL-17A 对酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1 和MITF 基因的mRNA 表达均有一定抑制作用（P<0.05）。该结果提示，IL-17A 可能通过抑制酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1 和MITF 基因mRNA 的表达，而影响黑素细胞合成黑素的功能。见图2。

图2 IL-17 对黑素细胞合成黑素关键基因mRNA 表达的影响

2.4 高浓度IL-17A 诱导黑素细胞凋亡的检测IL-17A 诱导的黑素细胞凋亡率为（5.42±1.66）%，空白对照组为（5．62±1．42）%，2 组差异无统计学意义（P>0.05），提示高浓度IL-17A 对体外培养的黑素细胞无明显诱导凋亡的作用。

3 讨论

人表皮黑素细胞是一种能合成和分泌黑素的树突状细胞。其合成的黑素是决定肤色的重要因素，具有吸收各种可见光和紫外线的能力，对防止紫外线对皮肤的损伤有重要的作用[2]。黑素的合成是一个在多种基因调控下由多种生物酶参与的复杂过程。其中酪氨酸酶基因、酪氨酸酶相关蛋白-1基因、酪氨酸酶相关蛋白-2 基因和MITF 是最关键的调控基因，而酪氨酸酶则是黑素合成过程中发挥关键作用的酶。各种原因导致的黑素细胞的酪氨酸酶基因和（或）MITF 基因表达异常、酪氨酸酶活性下降等均能引起黑素合成量下降，从而表现为色素减少性皮肤病。白癜风是色素减少性皮肤病中最常见的一种。目前认为，自身反应性淋巴细胞攻击自身黑素细胞，导致细胞发生凋亡或合成黑素的功能下降是引起白癜风的重要原因[3]。

Th17 细胞是近年发现的新Th 细胞亚群，广泛参与机体炎症反应、感染性疾病以及AID 的发病[4]。Th17 细胞主要分泌IL-17，能刺激多种细胞，如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等分泌多种细胞因子，从而发挥广泛的生物学效应[5]。我们之前的研究发现进展期白癜风患者外周血中Th17细胞比例及其分泌的促炎症细胞因子IL-17 水平升高，同时，患者进展期白斑边缘皮肤中有增多的IL-17+T 细胞浸润，这些现象提示，Th17 细胞及其分泌的细胞因子IL-17 可能在白癜风患者黑素细胞缺失和（或）功能破坏中发挥一定作用。本文研究了细胞因子IL-17 在体外对黑素细胞合成黑素功能的影响，以期进一步揭示Th17 细胞在白癜风患者黑素细胞破坏中发挥的作用。我们发现，IL-17A 可明显下调黑素细胞酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1 和MITF 基因mRNA 的表达，并抑制酪氨酸酶活性和黑素合成，这提示IL-17A 可通过抑制黑素合成过程中关键基因mRNA 的表达而破坏黑素细胞合成黑素的功能。新近的一个研究与我们的研究结果相似，发现用IL-17 作用于体外培养的黑素细胞后，黑素细胞出现形态收缩、MITF 及其下游基因表达下调，黑素合成下降等变化[6]。这些研究结果提示，白癜风患者外周血中升高比例的Th17 细胞、血清中浓度升高的细胞因子IL-17 和进展期白斑边缘浸润的IL-17+T 细胞可通过抑制表皮黑素细胞的功能而参与了白癜风的发病。有趣的是，我们在研究中并未发现IL-17 对体外培养的人黑素细胞具有明显诱导凋亡的作用，推测Th17 可能并非是引起白癜风患者黑素细胞破坏的主要因素，Th17 活化可能继发于CD8+细胞毒性T 淋巴细胞等其他免疫细胞对黑素细胞发动的自身免疫攻击，从而加重了黑素细胞的功能破坏，导致皮肤白斑的形成。

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