遗传性肾病综合征候选致病基因筛选策略

易翠莉(综述)，余自华※(审校)

(1南京军区福州总医院儿科，福州 350025； 2福建医科大学福总临床医学院儿科，福州 350025)

遗传性肾病综合征候选致病基因筛选策略

易翠莉1,2(综述)，余自华1,2※(审校)

(1南京军区福州总医院儿科，福州 350025； 2福建医科大学福总临床医学院儿科，福州 350025)

摘要：部分遗传性肾病综合征(NS)与编码足细胞蛋白的单基因突变有关，目前，仍有80%的遗传性NS致病基因不明。大家系单基因遗传病筛选候选致病基因首选定位克隆，而小家系候选致病基因筛选优先选择外显子组测序。对致病基因不明的遗传性NS小家系核心成员进行外显子组测序，挑选出非同义、罕见、位于保守区域、软件预测有致病性、基因型与表型共分离的变异，携带该变异的基因即为候选致病基因。

关键词：肾病综合征；外显子组测序；遗传性；候选致病基因

原发性肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)是儿童常见的肾小球疾病，10%～20%的患儿对激素耐药，即激素耐药型NS(steroid-resistant NS,SRNS)；SRNS预后差，50%的患儿可在5年内进展至终末期肾脏疾病，肾脏替代疗法为其最终治疗手段[1]。部分SRNS因编码足细胞蛋白的单基因突变所致，即遗传性NS。目前已经发现20余个导致遗传性NS的单基因，如NPHS1基因、NPHS2基因、α辅肌动蛋白4基因、CD2相关蛋白(CD2associated protein，CD2AP)基因、肌球蛋白1E基因等[2]。明确遗传性NS的基因诊断对治疗方案的选择、肾移植的预后评估、遗传咨询和产前诊断具有重要意义。但是，约80%遗传性NS致病基因仍未确定[3-4]。定位克隆、全基因组测序和外显子组测序均可应用于候选致病基因筛选，其中外显子组测序为当今寻找单基因遗传病致病基因的重要方法。现就遗传性NS候选致病基因筛选策略进行简要介绍。

1定位克隆筛选候选致病基因

定位克隆是筛选候选致病基因的传统方法，它是应用连锁分析的方法将候选致病基因定位于某一条染色体的特定候选位置或区域内，然后对该位置或区域内所有候选基因一一进行筛选、鉴定。此方法可靠性强，已经准确地筛选出许多经鉴定可导致遗传性NS的单基因，如NPHS1基因[5]、NPHS2基因[6]等。然而，通过定位克隆法筛选候选致病基因在整个研究过程中不仅耗费多、时间长，而且连锁分析往往需要基于一个甚至多个大家系才能得到有统计学意义的候选区间。常染色体显性遗传病往往需要在有6～12例患者的大家系基础上进行研究；对于常染色体隐性遗传病的研究，近亲结婚的小家系可与纯合区间结合完成定位，但非近亲结婚，且怀疑为复合杂合变异致病仍然需要大家系[7]。我国实行计划生育，患者人数少，家系少或小，加上外显不全和拟表型的存在均增加了连锁分析定位的难度。另外，疾病的基因异质性也使得基于表型相同多个小家系的连锁分析或纯合区间定位可能提示多个定位区间，亦显著增加了发现致病基因的难度[7]。

2全基因组测序筛选候选致病基因

全基因组测序是对生物基因组中的全部基因进行测序，覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息。新一代测序技术已经能够快速、低成本地进行全基因组测序。但由于全基因组信息庞大，后期数据分析、原始数据转换的花费远远超过测序所需，巨大的费用和工作量使它的应用受到很大限制；另外，如何对大量变异尤其是内含子区域的变异做出正确分析和解释也是一个难题[8]。目前，尚无应用全基因组测序筛选遗传性NS候选致病基因的报道。

3外显子组测序筛选候选致病基因

外显子组测序是指利用目标序列捕获技术将基因组的全部外显子区域DNA捕获后进行高通量测序的技术。2009年美国国家心肺血液研究所对国际人类基因组单体型图计划中的8个个体进行全外显子组测序，证实了这项技术在发现全外显子组中常见变异及罕见变异的敏感性及特异性；他们同时对4个已明确致病突变的弗里曼谢尔登综合征患者进行全外显子组测序，并准确地筛选出致病突变基因[9]。虽然找出的是已知致病基因，但他们的研究表明应用全外显子组测序可准确地找到一些单基因遗传病的致病基因。近年来，外显子组测序凭借自身优势得到广泛应用。新一代测序技术可对连锁分析获得的候选区间内所有候选基因同时进行测序，因此，如果有足够大的合适家系，定位克隆仍是筛选单基因遗传病候选致病基因的首选方法[7]。但目前的问题是很难获得足够大的合适家系，且还有很多单基因遗传病以散发的形式存在，无法进行有效的连锁分析。因此，与定位克隆相比，外显子组测序应用范围更广。外显子组测序可应用于因家系小而无法通过连锁分析进行定位克隆或一些散发的单基因遗传病候选致病基因的筛选[7]。2009年，Ng等[10]对3个米勒综合征家系中仅有的4例患者进行外显子组测序，筛选出新致病基因双氢乳清酸酯脱氢酶基因。2010年，Ng等[11]对10个散发的歌舞伎化妆综合征患者进行外显子组测序，筛选出了新致病基因组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶基因。

除外显子组测序外，全基因组测序也可应用于散发性单基因遗传病及小家系候选致病基因的筛选。但是相对全基因组测序，应用外显子组测序进行人类单基因遗传病候选致病基因的筛选性价比更高。人类基因组大约包含180 000个外显子(约30 Mb)，即全外显子组，仅占整个基因组序列的1%；人类大约85%的致病突变位于基因组的外显子蛋白编码区，大部分单基因遗传病的致病突变也位于外显子区域[12]。位于人类外显子蛋白编码区中许多罕见的非同义变异具有致病性，而位于非编码区即使是保守非编码区的变异大多为良性变异[10]。因此，外显子组测序能够在缩短实验周期、减少数据分析量及实验投入的基础上有针对性地得到大部分全基因组测序所能得到的信息。

4外显子组测序筛选遗传性NS候选致病基因的应用策略

外显子组测序比定位克隆法应用更广、更便捷，比全基因组测序性价比更高，因此，选择外显子组测序进行遗传性NS候选致病基因的筛选。2011年，Sanna-Cherchi等[4]在1个含有3个SRNS患儿的近亲结婚家系中对先证者进行外显子组测序结合纯合区间定位，筛选出了致病基因肌球蛋白1E基因。2013年，Esposito等[13]对1个局灶性节段性肾小球硬化合并心肌梗死家系中的2例患者进行外显子组测序，筛选出新致病基因核RNA转出因子5基因；同年，Gupta等[14]通过对1个家系内2例患先天性NS的姐妹进行外显子组测序，亦筛选出了新致病基因Rho二磷酸鸟苷解离抑制因子α基因。目前报道的遗传性NS致病基因的筛选多基于小家系进行，且相对于对单个个体或散发的数个个体进行外显子组测序，若能对1个家系内2个子代患者及其无患病双亲进行外显子组测序，能更好地进行遗传分析，明确发生重组事件的精确位置，确定双亲来源的染色体在子代中的情况，发现常见及罕见的单个核苷酸变异，明显缩小单基因遗传病候选致病基因的范围[15-16]。因此，尽管外显子组测序可应用于小家系及一些散发性单基因遗传病候选致病基因的筛选，但更适用于有2例或2例以上患者的小家系。

4.1外显子组测序技术路线应用外显子组测序筛选候选致病基因的过程大致分为3个步骤[17](图1[18])。首先，对基因组中所有已知编码蛋白质的外显子进行富集，新富集技术(如NimbleGen公司的基因捕获芯片及安捷伦SureSelect靶向序列捕获系统)可针对全外显子组进行捕获，这种富集方法较传统聚合酶链反应富集方法具有高特异性和高覆盖度，节省了大量时间、人力、物力和财力；然后，应用新一代测序技术对富集的全外显子组DNA序列进行高覆盖深度测序，目前已经有很多成熟的新一代测序产品(如Illumina测序仪、454基因组测序仪和SOLiD测序仪等)，与传统Sanger测序相比，应用新一代测序技术大大缩短了测序的时间及费用；最后通过比对、注释、筛选条件设置和生物信息学分析，筛选出候选致病基因[17]。

Het：杂合子；Hom：纯合子；del：缺失；Codon：密码子；Exon:外显子；Human：人类；Rat：大鼠；Mouse：小鼠；Frog：蛙；Gly：甘氨酸；Arg：精氨酸

图1外显子组测序筛选候选致病基因流程图[18]

4.2外显子组测序基本思路

4.2.1家系评估根据遗传性NS表型对家系成员进行严格筛查，明确家系成员的患病情况及家系特点，对患者进行已知的遗传性NS致病基因的检测和初筛，确认所研究的患者均无已知致病基因的变异[12-13,19]。

4.2.2外显子组测序根据所收集的家系特点，挑选遗传性NS家系内的核心成员进行外显子组测序。选择1个家系内的二子代患者结合或不结合其健康父母进行外显子组测序[14,16]；若家系内存活病患少，也有报道仅对1个家系内的1例患者进行外显子组测序[20]。

4.2.3测序结果分析外显子组测序后每个个体产生大量的数据，去除重复区域内的序列[9-10,16,21]，应用软件将经外显子组测序得到的序列与人类的基因组参考序列(如hg18、hg19等)进行比对[12,16,18-19,21-23]，经注释后每个个体将产生20 000～25 000个与参考序列不同的变异[12,18]。如何分析以缩小候选变异范围，并从中筛选出具有疾病风险预测价值甚至诊断价值的变异是最为重要的。

4.2.3.1非同义变异经比对产生的20 000～25 000变异中，有10 000～11 000会改变氨基酸序列[18]，即引起非同义变异，考虑同义变异致病的可能性非常小，因此选择非同义变异、编码区小片段插入或缺失变异及能引起剪切位点改变的变异[9-10,13,16,18-19,21-23]。

4.2.3.2罕见变异90%以上非同义变异为存在人群中的常见变异[18]，对于遗传性NS等大多数单基因遗传病而言，致病变异应为一些罕见变异，不存在于一些公共数据库或等位基因频率低的变异，因此予去除基因多态性数据库、单体型图数据库及千人基因数据库等公共数据库中已报道或等位基因频率>1%的变异[2,4,9-10,13,18-19,21-23]。

4.2.3.3保守区域内变异从无脊椎动物到人类均保守区域内的遗传物质可能是维持物种生存所必需的，若发生变异的位点处于高度保守区域内，说明该变异可能是致病甚至是致命的，因此选择的候选致病基因的变异应位于物种间保守区域内[10,12,22-23]。

4.2.3.4软件预测具有致病性的变异许多功能预测软件(如SIFT、Polyphen等)能够预测错义变异中氨基酸替换对蛋白质功能的影响，预测结果显示变异为致病性或非致病性，选取预测结果为有致病性的变异[10,16,18,22-23]。

4.2.3.5候选区间内变异若已结合连锁分析或家系内纯合区间定位获得一个候选区间，筛选出的变异应位于这些区间内，这些区间不仅进一步缩小了候选致病基因的范围，也提高了筛选出候选致病基因的准确率[22-23]。

4.2.3.6基因型与表型共分离变异经上述个体内数据的筛选后，接下去根据疾病模型进行遗传性NS家系内候选致病基因的筛选。若为常染色体隐性遗传性疾病，致病变异为纯合变异或复合杂合变异，家系内所有患病者含有相同变异，无患病的父母均为携带者，其余未患病者不携带相应变异或仅为携带者[14,16]；若为常染色体显性遗传性疾病，所有患者均携带相同变异，其他未患病者不携带相应变异[21,23]。应用上述条件经层层筛选，选择家系内表现为表型与基因型共分离的变异，携带该变异的基因即为候选致病基因。

4.3外显子组测序的不足外显子组测序技术在筛选遗传性NS等单基因遗传病方面存在众多优势，但它同样存在着一定的局限性。外显子组测序技术对全外显子组的捕获率不能达到100%，可能遗漏一些目标基因；外显子组测序技术对基因拷贝数变异检测效率较低；外显子组测序技术不能检测内含子区域的变异；外显子组测序技术检测结果存在假阳性可能[24]。但是,通过与其他技术结合可弥补外显子组测序技术的部分不足，如联合CONTRA软件可提高基因拷贝数变异的检出率，应用聚合酶链反应和Sanger测序对筛选出的候选变异一一验证排除假阳性等[25]。

5小结

定位克隆仍是大家系单基因遗传病筛选候选致病基因的首选方法，而小家系单基因遗传病筛选候选致病基因可选择全基因组测序或外显子组测序。因为外显子组测序较全基因组测序性价比更高，所以对小家系遗传性NS筛选候选致病基因优先选择外显子组测序。它能在短时间内用最少的病例数筛选出小家系遗传性NS候选致病基因。外显子组测序为遗传性NS候选致病基因筛选开辟了一条新路。

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The Strategy of Discovering Candidate Causative Genes for Hereditary Nephrotic Syndrome

YICui-li1,2,YUZi-hua1,2.

(1.DepartmentofPediatrics,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，Fuzhou350025,China; 2.DepartmentofPediatrics,FuzongClinicalMedicalCollege,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350025,China)

Abstract:Mutations in more than 20 different genes which are highly expressed in glomerular podocytes have been identified to lead to hereditary nephrotic syndrome(NS) in a subset of patients.However,the genetic cause of the majority(>80%) of hereditary NS remains unknown.Positional linkage based disease gene identification is a proven reliable strategy and will remain the gold-standard if suitable families are available.However,exome sequencing opens up a new road in the elucidation of genetic defects causing monogenic disorders of small families.Exome sequencing is performed on several core members of a family with hereditary NS to discover candidate causative genes.Non-synonymous and rare variants which affect highly conserved sequences and are predicted to have functional impacts and are completely co-segregated with the phenotypes are chosen,and the genes carrying the variants are identified as candidate causative genes.

Key words:Nephrotic syndrome； Exome sequencing； Hereditary； Candidate causative gene

收稿日期：2015-02-15修回日期：2015-04-21编辑：郑雪

基金项目：国家自然科学基金(81270766)；福建省科技计划项目(2013Y0072)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.035

中图分类号：R725

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)23-4320-03