不同来源菌株固态发酵对紫麦麸皮酚酸释放及抗氧化性能的影响

孙盈乾，张宪省，董海洲，侯汉学，张锦丽

(1山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271000;2山东农业大学生命科学院，山东泰安 271000)

生物活性物质能降低一些慢性疾病发生率，并且有抗氧化活性。因此对果蔬、农业工业废渣中具有生物活性的酚类化合物的研究越来越深入。酚类结构可以减缓或阻止氧化反应的进行［1］。由于彩色小麦麸皮中的酚酸大多数与纤维素木糖以酯键或醚键的形式相连［2］，以结合态形式存在，可被酸碱或微生物分解［3-5］。I-Hsin Lee［6］等研究了丝状真菌发酵黑豆，发酵黑豆的DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力和还原能力均有所提高。Ming-Yen Juan［7］等选用枯草杆菌BCRC14715固态发酵黑豆，结果表明发酵提高了总酚和花青素含量、DPPH·清除能力、Fe2+螯合能力。K.Katina［8］等研究了酵母菌、乳酸菌及混合发酵对天然黑麦及发芽黑麦营养品质的影响，研究结果表明，发芽后用啤酒酵母发酵能显著提高游离酚酸的含量。

目前国内外的相关研究已显示出固态发酵小麦麸皮、秸秆、豆类等能提高抗氧化性能。为提高彩麦麸皮的抗氧化能力，本文采用已从麸皮中中分离出菌种，用固态发酵的方法提高紫麦麸皮中的游离酚类物质含量，以期找到能有效降解与多糖和木质素相连的酯键或醚键，释放出游离的酚类物质的菌种，为微生物发酵麸皮及其在食品生产中的应用提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

由肥城富士康面粉厂不同来源的麸皮中筛选出的霉菌13 株。其中Ⅰ:取自放置于阴暗屋内尼龙袋中已发生自然霉变的麸皮;Ⅱ:取自背阴处墙角，有泥土处，散落的湿润的麸皮;Ⅲ:取自水泥地路面处，自然堆积的麸皮;紫色小麦:济南民天面粉有限公司。

1.1.2 试剂

木糖、三氯化铁、地衣酚、DPPH、无水碳酸钠、没食子酸、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、无水乙醇均为分析纯。RP-HPLC 所用试剂为色谱纯。

1.2 主要仪器与设备

M2e 多功能微孔板检测仪 (USA，Molecular Devices);SHB 型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DLSB-5 型低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司);R-1001 旋转蒸发器(郑州长城科工贸有限公司);高效液相色谱仪(LC-20AT 高压泵)，日本岛津公司，岛津色谱柱Inertsil ODS-SP (250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.3 试验方法

紫色小麦麸皮:紫色小麦→脱皮→粉碎→过筛(40 目)→灭菌(100℃，15min)。

1.3.1 麸皮的固态发酵

从斜面保藏培养基上挑取几环孢子于无菌水中，调整细胞个数为106个/mL。称取适量麸皮，加入菌浮液于适宜温度下发酵。发酵后的紫麦麸皮样品于50℃烘箱中干燥，磨碎。

1.3.2 总酚及酚酸的提取及测定

(1)总酚及酚酸的提取

总酚的提取。用80%的甲醇提取发酵后的紫麦麸皮，超声辅助提取1h，离心。重复提取1 次。合并上清液，浓缩至无醇，用甲醇定容至10mL。

酚酸的提取。发酵后的紫麦麸皮中加入正己烷，超声辅助脱脂1h，离心。重复脱脂1 次，用甲醇提取脱脂后的紫麦麸皮，合并上清液，浓缩至无醇，用盐酸调节pH 为2，用等体积乙醚/乙酸乙酯萃取3 次，合并有机相于40 ℃浓缩干燥，色谱甲醇复溶后得游离型酚酸。

(2)总酚含量的测定

100μL 总酚溶液中加入6mL 蒸馏水，涡旋震荡5s，静置1～8min;加入1.5mL Na2CO3溶液，加蒸馏水定容到10mL。室温避光条件下，将密封的试管静置2h;765nm 下测定吸光度。以空白试剂做参比，没食子酸为标准品，制作标准曲线。试验确定回归方程为y=0.116 8x－0.005 32，相关系数R2=0.997 5，其中x:没食子酸浓度(μg/mL)。

(3)DPPH·清除率

取总酚溶液0.1mL 加3.9mL 6×10－5mol/L DPPH 溶液，室温黑暗下反应60min。然后在517nm 处，测定0和60min 时的吸光度。

(4)酚酸组成

色谱条件:流动相为A—水/冰醋酸(0.5%，v/v);B—乙腈/冰醋酸(0.5%，v/v)。梯度洗脱为0～20 min，B 为10% ;20～30 min，B 为10%～50% ;30～40 min，B为50%～100% ;40～45min，B 为100%～10%。进样量为20μL;进样前酚酸溶液均用0.45μm 微孔滤膜过滤。定性定量方法为保留时间和最大吸收波长定性，外标法定量。

图1 混合标准品的RP-HPLC 谱图(280 nm)

将酚酸标准品按一定浓度溶于乙腈中，制得11 种标准品的混合标样，进行高效液相色谱检测，确定其保留时间及分离效果。所得标准品的液相色谱图如图1 所示。将11 种标准品按一定倍数稀释，绘制标准曲线，所得到标准曲线的相关系数列于表1 中。

表1 11 种标准样品的相关性系数

1.3.3 水溶性阿拉伯木聚糖的测定

取100mg 发酵后的紫麦麸皮，加入10mL 水，30℃振荡2h，离心;取1mL 上清液，加入1mL 4 mol/L 的HCl，在密封的试管内100℃保持2h，冷却;取1 mL 加入到试管，加入2mL 水，3mL FeCl3和0.3mL 地衣酚;沸水浴加热30min，取出后加入蒸馏水到10mL，冷却;670 nm 下测吸光度。以空白试剂做参比，木糖为标准品，制作标准曲线。试验确定回归方程为y=0.54x－0.002，相关系数R2=0.998，其中x:木糖浓度(mg/mL)。

1.3.4 数据统计分析

采用SPSS 18.0 统计软件的单因素方差分析(ANOVA)和Duncan 多重比较法进行数据统计(α＜0.05)，所有测定重复3 次，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 霉菌发酵紫麦麸皮的总酚含量

Ⅱ-M1 对总酚含量的释放效果较好(图2)。由样本Ⅱ筛选出的霉菌发酵紫麦麸皮后的总酚含量没有显著性差异。样本Ⅰ筛选出的霉菌发酵紫麦麸皮后的总酚含量差异显著。

霉菌固态发酵紫麦麸皮后的总酚含量增加，这一结果与Dordevic 等［9］、JEFFREYMOORE 等［10］的研究结果一致。紫色小麦麸皮中加入霉菌的菌悬液固态发酵，可以断裂与酯类连接的酯键或醚键，使酚类物质由结合型变为游离型，含量增加。麸皮中加入霉菌，在发酵过程中会产生内源性的酶类，使麸皮的细胞壁发生降解，释放出更多的酚类化合物。

图2 霉菌发酵对紫麦麸皮总酚含量的影响

2.2 霉菌发酵紫麦麸皮的DPPH·清除率

由图3 可以看出，Ⅱ-M1、Ⅲ-M6 固态发酵紫色小麦麸皮后的DPPH·清除率的增加较为显著。Ⅱ、Ⅲ来源筛选出的霉菌固态发酵紫麦麸皮后的DPPH·清除率差异显著。

图3 霉菌发酵紫麦麸皮的DPPH·清除率

霉菌固态发酵紫色小麦麸皮后的DPPH·清除率均有一定程度的提高，霉菌最高增加了0.33 倍。紫麦麸皮中总酚含量与DPPH·清除率增加程度并不是一致的。DPPH·清除率大小可能是多种生物活性成分协同作用的结果，在发酵过程中，微生物作用于麸皮中，除了释放出游离的酚酸外、还释放出了类黄酮、木酚素等化合物，用FC 法测定出的是酚类化合物的含量，而DPPH·的清除并不是这些酚类化合物作用简单加和的结果。研究表明，酚酸［11］和类黄酮［12］有一定的清除自由基的效果。

2.3 霉菌发酵紫麦的酚酸组成

由表1 可以看出，霉菌发酵紫麦麸皮后，麸皮中游离型酚酸以阿魏酸为主。异阿魏酸和水杨酸的含量次之，原儿茶酸和丁香酸均可检测到，但是含量相对较低。部分菌株发酵后，没有检测到没食子酸和对羟基苯甲酸。其中第Ⅱ-M1、Ⅲ-M5 株菌发酵后释放出的酚酸含量相对较高，达到了2 600μg/g 麸皮以上。

固态发酵后释放出的酚酸以阿魏酸为主约占酚酸总量的50%～91%，其次主要是对香豆酸、异阿魏酸，这说明固态发酵对羟基肉桂酸的衍生物的释放效果较好。总的来说，肉桂酸类酚酸的含量高于苯甲酸类的酚酸。与丁岩［13］关于紫麦麸皮游离中酚酸组成的研究结果相比，发酵后阿魏酸的含量显著提高，检测到没食子酸、异阿魏酸和水杨酸。

表2 霉菌发酵紫麦麸皮的游离酚酸组成(μg/g 脱脂麸皮)

2.4 霉菌发酵紫麦麸皮的可溶性阿拉伯木聚糖含量

由图4 可以看出，霉菌发酵后可溶性阿拉伯木聚糖提取率一定程度的降低，这可能是因为霉菌在固态发酵过程中，能够较大程度的以阿拉伯木聚糖作为碳源生长。

麸皮发酵过程中内部结构变的疏松，易于水溶性阿拉伯木聚糖的溶出。阿拉伯木聚糖与羟基肉桂酸等通过酯键、醚键形成酯类、醚类，在发酵过程中，酯键、醚键断裂，酚酸和可溶性阿拉伯木聚糖被释放，微生物维持自身生长的需要，可利用的营养成分已经基本消耗殆尽时，利用了一部分释放出的可溶性阿拉伯木聚糖，使发酵后总酚含量高的菌株，可溶性阿拉伯木聚糖含量反而相对较低。

3 结论

图4 霉菌固态发酵紫麦麸皮的可溶性阿拉伯木聚糖含量

适宜条件下固态发酵彩麦麸皮是提高游离酚酸含量有效的方法，不同种类菌株的发酵效果各不相同。选用适当的菌株发酵，对提高酚酸释放及抗氧化能力有重要的意义。实验室筛选出的霉菌固态发酵紫麦麸皮后，研究总酚含量、DPPH·清除率、酚酸组成以及可溶性阿拉伯木聚糖含量。不同菌株固态发酵的试验结果表明，霉菌的发酵效果最好，霉菌Ⅳ-11 固态发酵紫麦麸皮后，具有较好的酚酸释放及抗氧化能力。霉菌Ⅳ-11 发酵后总酚含量为3.55mg/g 麸皮，DPPH·清除率为51%，酚酸含量为2 922μg/g 麸皮。

不同来源麸皮筛选出的菌株及同一来源麸皮中筛选出的菌株固态发酵紫麦麸皮的结果呈现出差异性，这体现了不同的微生物群落对底物的利用有不同的特征。固态发酵有利于酚酸的释放及抗氧化能力的提高，但菌株选择不恰当会使酚酸含量降低，Jose Antonio Curiel［14］用乳酸菌发酵食品，酚酸含量降低。固态发酵过程中，发酵菌株的选择非常重要。

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