解淀粉芽胞杆菌NCPSJ7对采后苹果轮纹病的生物防治作用

黄玲玲 ，裘纪莹，唐 琳，陈相艳，刘孝永，周庆新，王永慧，陈蕾蕾

(1山东省农业科学院农产品研究所，济南 250100;2山东师范大学生命科学学院，济南 250014;3山东省临沂市河东区农业局，山东临沂 276034)

采后腐烂是水果采后需要预防的一个重要问题，发达国家10%—30%的水果是损失于采后腐烂，在发展中国家损失率更大［1］。果蔬采后腐烂主要是真菌病害［2］，而苹果的采后损失主要由轮纹病和炭疽病引起。苹果轮纹病菌通过危害苹果树的枝干和果实，引起采前和采后苹果轮纹病的发生［3］。目前控制苹果轮纹病的方法仍然以化学药剂为主，尤其是果园苹果轮纹病的防治中长期使用化学农药，造成果园的污染［4］，同时病菌抗药性的产生导致传统化学药剂的防效降低［5，6］，应该加以重视。采后苹果轮纹病的防治也多采用化学药剂浸泡的方法，如采用500 倍复方多菌灵预先浸泡1min，再自然晾干贮藏［7］。由于使用化学农药的种种危害，目前科学界在不断地寻找一些新型低毒可替代化学杀菌剂。邹宗峰等［8］开展了新型农药60.00%唑醚·代森联(百泰)WG 和25.00%吡唑醚菌酯(凯润)EC 防治苹果轮纹病的试验，结果显示这两种新型农药的防治效果比较理想。王芳芳［9］研究了水杨酸对采后苹果果实轮纹病的抑制效果，还有一些研究者利用生物防治的方法抑制采后苹果轮纹病，比如某些地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、木霉、荧光假单胞菌等菌体及其代谢产物的单种或复合生物防治都有一定的效果［10-12］。

解淀粉芽孢杆菌属于芽胞杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌具有很高亲缘性并且具有广泛抑菌谱的细菌，其菌体及一系列代谢产物可以抑制细菌以及真菌的生长［13-15］，并且毒性较低［16］，是一类很有前途的生防制剂来源。目前已经开发出以解淀粉芽孢杆菌为活性成分的微生物杀菌剂，并获得了生产许可［17］。同时，目前文献报道的解淀粉芽孢杆菌抗菌代谢产物有伊枯草菌素、杆菌霉素D、表面活性素等脂肽类抗生素［18-21］以及抗菌蛋白等［22，23］。本研究通过探讨解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7 菌体及其抗菌蛋白对苹果轮纹病菌LW182 的抑制作用以及对采后苹果轮纹病的生物防治作用，以期更深入地了解解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7 的产业化应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果:市售红富士;解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7 由本实验室分离、鉴定、保存;轮纹病菌LW182 由山东省农业科学院植物保护研究所惠赠。牛肉膏蛋白胨培养基［24］用于拮抗菌的培养和保存;PDA 培养基［24］用于病原菌的培养、保存和牛津杯法测定抑菌效果;发酵培养基［25］用于拮抗菌胞外抗菌蛋白的发酵，具体配方为:葡萄糖5g，酵母浸膏7.5g，蛋白胨7.5g，(NH4)2SO45g，NaCl 5g，蒸馏水1 000mL，pH 7.0;纳他霉素购自上海耐今实业有限公司。

1.2 仪器与设备

CR22GⅢ高速冷冻离心机，日本日立公司;Stirred Cell Model 8400 超滤装置(配有3000u 超滤膜和氮气罐)，美国Millipore;霉菌培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司;PQX-430D 智能人工气候箱，宁波东南仪器有限公司。

1.3 牛津杯法测定抑菌效果

1.3.1 病原菌孢子菌悬液的制备

将苹果轮纹病菌LW182 接种于PDA 平板，28℃培养7d，即为病原菌平板。无菌条件下用直径7mm 打孔器打孔取一环放入灭菌的1.5mL EP 管中，用无菌刀片切碎并添加1mL 无菌水混匀，制备病原菌孢子菌悬液，4℃保存，备用。

1.3.2 处理液的制备

将拮抗菌NCPSJ7 接种于牛肉膏蛋白胨平板，37℃培养24h。挑取单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，180r/min 摇床培养24h，按3%接种量将已活化好的拮抗菌接入发酵培养基中，37℃，180r/min 摇床培养6d，既得供试发酵液。发酵液于4℃，10 000r/min 离心20min，取出上清液，菌体沉淀加无菌水清洗再离心，最后调节菌浓度约为105个/mL，既得供试菌悬液。发酵上清液经超滤杯用截留分子量为5KDa 的膜超滤，浓缩5 倍，并用0.22μm 滤膜过滤除菌，即为供试胞外抗菌蛋白粗提液。

1.3.3 抑菌圈试验

取100μL 病原菌孢子菌悬液于空白平皿中，倒入PDA 培养基混匀，待凝固后，每个平板放入1 个牛津杯，分别添加菌悬液、发酵液及不同浓度的胞外抗菌蛋白粗提液100μL，于28℃培养7d 后观察牛津杯周围的抑菌圈直径，并以无菌水作为空白对照。

1.4 果实打孔接种法试验抑菌效果

1.4.1 果实预处理

分别选择无病害、无伤口、成熟度和大小一致的市售红富士苹果，用2%NaClO 浸泡2min，再用自来水冲洗干净，自然晾干。

1.4.2 果实打孔接种法试验

在果实表面用7mm 打孔器打直径7mm，深5mm 的孔，在伤口处接种20μL 病原菌孢子菌悬液以检测病原菌果实致病性，将果实放入保鲜盒，置于相对湿度95%左右，28℃的恒温培养箱，定期观察梨果实腐烂情况。在每个伤口接种20μL 病原菌孢子菌悬液，并且分别接种40μL NCPSJ7 发酵液、菌悬液和抗菌蛋白粗提液来检验NCPSJ7 对接种苹果的轮纹病菌的抑制效果。以单独接种病原菌孢子菌悬液和无菌水的果实为阳性和阴性对照。每次处理3 个果实，重复3 次。

1.5 果实防腐试验

分别将NCPSJ7 发酵液、抗菌蛋白粗提液和那他霉素(3mg/mL)与病原菌孢子菌悬液以2∶1 的比例混匀，均匀喷洒在处理好的苹果表面，待苹果自然晾干后用保鲜盒分装，并置于相对湿度90%，28℃的人工气候箱中，定期观察记录果实腐烂情况。分别以单独喷洒病原菌和无菌水的果实为阳性和阴性对照。每组处理10 个苹果。坏果率计算:坏果率/%=坏果数(个)/果实总数(个) ×100%。

2 结果与讨论

2.1 牛津杯法测定抑菌效果

首先考察NCPSJ7 菌悬液、发酵液及胞外抗菌蛋白粗提液对苹果轮纹病病原菌LW182 的平皿抑制效果(表1)。结果显示，各处理液对苹果轮纹病菌LW182 均有一定的抑制作用，其中菌悬液的抑制效果最好，其次是发酵液，但是两者差异不是特别明显。胞外抗菌蛋白粗提液和菌悬液、发酵液相比，效果略差，但是抑菌效果也比较明显。

表1 不同处理液对病原菌苹果轮纹病菌LW182 的抑制作用

2.2 果实打孔接种法试验抑菌效果

首先验证苹果轮纹病病原菌LW182 对苹果果实的致病性，从附图可见，采用打孔法接种的LW182 具有很强的侵染苹果果实的能力，主要表现为:整个苹果腐烂，苹果表面轮纹状斑纹、变色和出水比较严重，接种区域有明显的病原菌菌丝生长。可见，LW182 可以作为苹果轮纹病侵染苹果的指示菌。

附图 LW182 侵染苹果试验

进一步研究NCPSJ7 对打孔法接种苹果的轮纹病菌LW182 的抑制效果，结果如表2 所示。和阳性对照相比，供试的NCPSJ7 各处理液对接种果实的轮纹病菌LW182 均有很好的抑制作用，主要表现为:果实病斑直径明显变小，而且具有比较明显的抑制病原菌菌丝生长和防止果实变色作用。同时抑制效果的差异较大，3 种处理液中以抗菌蛋白粗提液效果最好。用抗菌蛋白粗提液处理后的果实病斑直径小，接种区域无菌丝生长，果实表面不变色。

表2 NCPSJ7 处理液对接种苹果病原菌的抑制

2.3 果实防腐试验

采用发酵液和抗菌蛋白粗提液进行苹果防腐保藏试验，结果如表3、表4 所示。从表3 来看，喷洒NCPSJ7发酵液及其稀释液的3 个试验组中，保藏前期的坏果率随发酵液浓度的降低而降低，保藏后期的坏果率随发酵液浓度降低而增加。和阳性对照相比，发酵液原液组前期坏果率比阳性对照高，后期比阳性对照略低。分析可能的原因是轮纹病菌LW182 侵染苹果有一定的潜伏期，前期侵染能力不强，但潜伏期后的侵染迅猛。而果实保藏前期浓度较高的拮抗菌会侵染损伤果加速其腐烂，导致保藏前期的坏果率高。发酵液的10 倍和100 倍稀释液组可以延缓果实腐烂，但保藏后期作用不明显，可能是浓度较低的拮抗菌不足以发挥其防腐作用。

表3 发酵液的苹果防腐保藏试验结果(坏果率，%)

从表4 来看，采用胞外抗菌蛋白处理苹果，阳性对照组于7d 后开始腐烂，而胞外抗菌蛋白处理组12d 才开始腐烂。尤其是20d 以后，阳性对照组腐烂迅速，而胞外抗菌蛋白处理组的坏果率明显低于阳性对照组，并且效果与那他霉素相当。可见，NCPSJ7 胞外抗菌蛋白处理能有效降低LW182 对苹果的侵染，从而降低坏果率，延长保藏期。

表4 胞外抗菌蛋白的苹果保藏试验结果(坏果率，%)

3 结论

本文采用平板牛津杯法、果实打孔接种法研究解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7 菌悬液、发酵液和抗菌蛋白粗提液对苹果轮纹病菌LW182 的抑制作用，采用果实防腐试验研究发酵液和抗菌蛋白粗提液在采后苹果轮纹病生物防治中的应用价值。牛津杯法的结果显示菌悬液对LW182 的抑制效果最好，其次是发酵液，抗菌蛋白粗提液的效果略差，但是抑菌效果也比较明显。果实打孔接种法显示抗菌蛋白粗提液的抑制效果非常好，可明显减小果实病斑直径，抑制接种区域病原菌菌丝生长及果实变色，发酵液和菌悬液的效果略差，但和阳性对照相比，抑制作用也比较明显。可见，供试的3 种处理液对苹果轮纹病菌LW182 都有很好的抑制作用，但是采用上述两种方法得到的结果也有不一致之处，供试处理液对病原菌的抑制效果受载体的影响很大。采用发酵液和抗菌蛋白粗提液喷洒苹果表面进行防腐保藏效果的研究，结果抗菌蛋白粗提液对同时喷洒苹果轮纹病菌的果实具有非常明显的防治作用，效果和纳他霉素相当，但发酵液的效果不明显。这和我们前期进行的梨青霉病生物防治的结果类似。可见，解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7 主要是通过分泌抗菌蛋白来抑制苹果轮纹病菌，而且NCPSJ7 菌体可能对苹果果实产生一些危害。所以，NCPSJ7 抗菌蛋白适合用于防治苹果轮纹病，但直接利用该菌株的菌体进行生物防治的构想是不现实的。下一步我们将对解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7 胞外抗菌蛋白的喷雾干燥工艺及与其它防腐剂、保鲜剂的复配等开展进一步的研究。

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