胶原多肽对亚急性酒精中毒大鼠的保护作用研究

林 兵，于永超，陈 禹，石 劢，杨勤兵

(1中日友好医院营养科，北京 100029;2北京清华长庚医院临床营养科/清华大学医学中心，北京 102218)

亚急性酒精中毒的病程介于急慢性酒精中毒之间，是慢性酒精中毒的早期损伤，主要表现为肝功能损伤、营养素代谢紊乱和神经系统损伤等方面。生物活性肽对于酒精中毒的保护作用已有报道，如玉米寡肽［1］、谷胱甘肽［2］等。本研究采用的胶原多肽(Collagen Peptides，CPs)是一种来源于深海鱼皮的寡肽混合物，易吸收、水溶性好、肠胃刺激小、价格便宜。已有研究显示，CPs 具有多种生物活性，包括延缓细胞老化、降血压、抑制学习记忆功能下降、抗衰老等［3］，而对于酒精中毒领域没有相关的报道。本研究以胶原多肽作为干预物，观察其对连续4w 摄入酒精大鼠的一般状况、肝功能、脂质代谢、蛋白质代谢、氧化应激水平、乙醇代谢酶等的影响，首次评价其对亚急性酒精中毒大鼠的作用，为胶原多肽的应用提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 胶原多肽

胶原多肽为淡黄色粉末状，相对分子质量在100—860Da，以深海鱼的鱼皮为主要原料，采用复合偶联酶解技术生产的小分子多肽混合物，由北京中食海氏生物技术有限公司提供。

1.2 实验动物

SPF 级SD 大鼠，雌性，8—10w 龄，体重220—250g，由北京大学医学部实验动物中心提供，许可证号:SYXK (京)2011—0039，饲养环境温度21—23℃，湿度50%—60%RH。

1.3 主要试剂和仪器

HITACHI 7180 全自动生化分析仪 (日本);肝ADH、组织蛋白(pro)、血清SOD、MDA 检测试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供;UV7512GD 型紫外可见分光光度计，上海欣益仪器仪表有限公司;乙醇和叔丁醇为分析纯。

1.4 实验方法

大鼠按体重随机分为正常对照组、模型对照组和CPs 高中低干预组，模型对照组12 只，其余每组10 只。乙醇稀释为50%体积分数的酒精，灌胃剂量为15mL/kg，对照组蒸馏水灌胃15mL/kg。高中低干预组在酒精灌胃1h 后分别给予CPs 0.225、0.45 以及0.9g/kg·BW，对照组给予等剂量蒸馏水，每周称重调整灌胃量。

记录大鼠一般生活状况和进食量，第29d 处死大鼠，股动脉取血，分离血清，检测ALT、AST、ALB、TB、TC、TG、SOD 和MDA 水平，取部分肝组织检查ADH 和组织pro 水平。

1.5 统计学处理

所有结果以均数± 标准差表示，数据分析采用SPSS15.0 统计软件进行单因素方差分析，以LSD 法行两两比较，确定P＜0.05 时差异有统计学意义。

2 结果与分析

实验结束时共48 只大鼠完成实验，期间模型对照组和低剂量组各1 只大鼠因灌胃误呛入肺而导致死亡，低剂量组和高剂量组各有1 只因不能长期耐受酒精而死亡(长期精神萎靡，解剖肺部无明显渗出)，其余48 只大鼠均存活。

2.1 大鼠体重变化

摄入酒精后模型对照组大鼠较正常对照组大鼠精神状态差、食欲差、大便多溏泻、反应迟钝、而且活动减少，体重增长缓慢(P＜0.05)，干预组大鼠的症状比模型对照组轻，体重较模型对照组有升高的趋势，但是不能逆转体重的减轻，差异无统计学意义(表1)。

表1 大鼠体重变化(±s，g)

表1 大鼠体重变化(±s，g)

注:与正常对照组相比，△P＜0.05

2.2 血清肝功能指标

与正常对照组相比，模型对照组大鼠血清中ALT、AST 显著升高(P＜0.05)。与模型对照组相比，高剂量组大鼠的ALT 水平明显下降(P＜0.05)，并且各剂量组大鼠血清的AST 水平明显下降(P＜0.05)(表2)。

表2 大鼠血清中ALT、AST 水平(±s)

表2 大鼠血清中ALT、AST 水平(±s)

注:与正常对照组相比，△P＜0.05;与模型对照组相比，* P＜0.05

2.3 血清抗氧化指标

模型对照组大鼠的SOD 水平明显降低，而血清MDA水平明显升高(P＜0.05)。与模型对照组相比，各剂量组大鼠SOD 活性有升高的趋势，低剂量组SOD 水平明显升高(P＜0.05)，其余各组差异无显著性;低剂量组和中剂量组的MDA 水平比模型对照组低，差异有统计学意义(表3)。

表3 大鼠血清中SOD、MDA 水平(±s)

表3 大鼠血清中SOD、MDA 水平(±s)

注:与正常对照组相比，△P＜0.05;与模型对照组相比，* P＜0.05

2.4 脂类与蛋白代谢变化

模型对照组的TG 和TC 含量较正常对照组明显升高，而低剂量组和高剂量组大鼠血清TG 含量比模型对照低，差异有显著性;高剂量组TC 含量比模型对照组低，差异有显著性。模型对照组的TP 和ALB 与正常对照组相比无明显差异，但是A/G 比的差异有显著性，各剂量干预组并不能减小这种差异，反而有扩大的趋势(表4)。

2.5 大鼠肝脏ADH 水平

模型对照和干预组组的ADH 活性比正常对照组高，但各组间差异无显著性(正常对照组与模型对照组间P=0.087)(表5)。

表4 大鼠血清中TG、TC、TP、ALB、GLB 水平及A/G 比(±s)

表4 大鼠血清中TG、TC、TP、ALB、GLB 水平及A/G 比(±s)

注:与正常对照组相比，△P＜0.05;与模型对照组相比，* P＜0.05

表5 大鼠肝脏ADH 水平(±s)

表5 大鼠肝脏ADH 水平(±s)

3 讨论

本研究采用酒精灌胃造成大鼠亚急性酒精中毒模型，研究CPs 对于酒精诱导大鼠早期损伤的保护作用。肝脏为酒精代谢的主要器官，肝损伤是酒精中毒最常见的靶器官，结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠一般状况较差，体重增长缓慢，血清ALT、AST 比空白对照高，差异均有统计学意义。ALT 和AST 是肝细胞中的正常代谢酶，当肝细胞出现损伤时，这两种转氨酶进入血清便增多。通过测定血清转氨酶的活性，即可作为肝细胞损伤的评价指标，大鼠转氨酶的升高表明连续4w 饮酒造成了大鼠肝损伤，CPs 干预可以逆转其中的某些变化，干预组大鼠血清ALT 和AST 水平较模型组降低，提示CPs 具有减轻酒精诱导的肝损伤的作用。进一步分析结果发现，血清ALT 的显著变化常见于各种急性病毒性肝炎、药物引起急性肝细胞损伤。相反，在酒精性肝炎中，AST 一般增高至正常值的2—10 倍，而ALT变化幅度较小［4］。结果显示，模型组AST 升高的幅度(约2 倍)明显高于ALT (约1/4)，这可能与酒精性肝炎的发生有关，肝脏炎症反应是酒精性肝病的重要病理学改变［5］，提示CPs 可能具有减轻炎症反应的作用。

目前，关于酒精中毒的致病机制仍有待确定，而氧化应激和脂质过氧化是普遍认可的病因之一［6］。机体大量摄入乙醇后，抗氧化物质消耗增加，而且酒精中毒使得抗氧化酶活性受到抑制，机体处于氧化应激状态，早期的主要变化是其主要代谢场所——肝细胞发生膜脂质过氧化反应。其中，血清MDA 含量反应了机体脂质过氧化的程度。本实验结果显示，连续4w 摄入酒精后大鼠的SOD 活性下降，血清中MDA 水平升高。某些剂量CPs 干预使得大鼠SOD 活性升高，MDA 水平下降，表明CPs 可以在一定程度上矫正机体的氧化应激状态，减轻脂质过氧化损害，这也与CPs 之前的研究结果相符［7］。

长期饮酒会造成机体营养素代谢紊乱，脂类代谢异常尤其常见。摄入酒精后大鼠血清TG 和TC 含量明显升高(P＜0.05)，酒精引起机体脂类代谢紊乱在以往的研究中已有报道［4］，而以往研究也发现，胶原多肽具有改善脂类代谢的作用［8，9］。结果表明，低剂量和高剂量CPs 干预后大鼠血清TG 含量明显降低，高剂量组大鼠TC 含量明显下降，这表明CPs 具有一定的降血脂作用，这可能是减轻酒精中毒损害的重要机制。

酒精对于机体各组织器官的损伤与时间、剂量相关，呈现出蓄积作用，本实验设计为诱导酒精中毒早期损伤，以肝损伤、脂代谢异常、氧化应激失衡等为主要表现，时间为4w，没有观察到中晚期酒精中毒如严重的代谢紊乱、肝硬化、乙醇代谢酶活性改变等表现。白蛋白由肝细胞合成，血清白蛋白浓度是肝脏的合成功能的评价指标，各种慢性肝病常可见低白蛋白血症［4］。4w酒精灌胃没有造成大鼠血清白蛋白水平的变化，这表明肝合成功能并没有受到影响。模型组A/G 比高于正常对照组(P＜0.05)，各剂量干预组并不能减小这种差异，具体的原因尚不清楚，可能与酒精致免疫系统的异常有关。ADH 是乙醇代谢的特异性酶，在慢性酒精中毒的过程中具有重要的作用，有研究者指出，随着乙醇的持续摄入，ADH 的活性会随之升高［10］，因此降低ADH的活性是减轻酒精中毒损害的重要机制，本研究模型对照组大鼠肝脏内的ADH 活性较正常对照组有一定的升高(t 检验P=0.087)，而CPs 干预后ADH 的活性有一定程度的下降，但是差异无显著性。

综上所述，CPs 对于酒精诱导的大鼠早期损伤具有保护作用，包括减轻肝脏损伤、提高机体抗氧化水平、改善脂类代谢等，其对于ADH、蛋白质代谢的影响仍需进一步的研究证实。

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