追风透骨胶囊中马兜铃酸A的限量检查

吕情花

追风透骨胶囊中马兜铃酸A的限量检查

吕情花

目的完善追风透骨胶囊中马兜铃酸A的限量检查。方法用Waters C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱检测马兜铃酸A, 流动相：乙腈-0.4%冰醋酸(30∶70), 流速：1.00 ml/min, 检测波长∶393 nm。结果用本法测定10批不同批号的追风透骨胶囊, 均能准确的判断为未检出马兜铃酸A。结论本法结果准确, 可完善追风透骨胶囊中马兜铃酸A的限量检查。

高效液相色谱法；追风透骨胶囊；马兜铃酸A；限量检查

追风透骨胶囊为国家食品药品监督管理局标准收载的品种[1]。由制川乌、细辛、地龙等二十四味中药组成, 具有通经络、祛风湿、镇痛祛寒等功效。用于风寒湿痹、四肢痹痛、手足麻木等。标准中用高效液相色谱法(HPLC法)测定马兜铃酸A的限量, 但在试验中发现, 该试验条件下有其他物质的干扰, 影响结果的判断。追风透骨胶囊属国家基本药物,国家食品药品监督管理总局每年都会对每一种基本药物进行监督抽查检验, 如果标准方法存在问题, 那势必会造成错误的结论。因此, 本文改变了一些实验条件, 排除其他物质的干扰, 更能准确的反映药品的质量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 Waters e2695 HPLC色谱仪, METTLER TOLEDO XS205十万分之一天平；水为Ⅰ级纯化水, 乙腈为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。马兜铃酸A对照品购自中国药品生物制品检定所(批号：110746-200806)10批追风透骨胶囊由湖南省回春堂药业有限公司提供, 批号分别为20130514；20130305；20130308；20121213；20140521；20141203；20131108；20130206；20140409；20140709。

1.2 试验方法

1.2.1 标准方法

1.2.1.1 色谱条件及系统适用性试验 以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填料, 以乙腈-0.4%冰醋酸(35：65)为流动相,流速：1.00 ml/min, 检测波长393 nm, 理论板数按马兜铃酸A峰计应＞5000, 分离度＞1.5。

1.2.1.2 对照品溶液 精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的马兜铃酸A对照品约9 mg, 加甲醇约90 ml, 超声处理5 min使溶解, 放冷, 加甲醇稀释至100.00 ml, 摇匀, 再精密量取2 ml, 加甲醇稀释至50.00 ml, 摇匀, 即得。

1.2.1.3 供试品溶液 精密取供试品细粉10 g, 置250 ml圆底烧瓶中, 加甲醇约80 ml回流提取1 h, 滤过, 残渣加甲醇20 ml洗涤, 滤过, 合并滤液, 水浴蒸干, 残渣加0.1 mol/L氢氧化钠溶液20 ml分次溶解洗涤, 转入分液漏斗中, 再加氯仿40 ml分次溶解洗涤, 转入分液漏斗中, 静置使分层, 分取碱水层, 氯仿液再加0.1 mol/L氢氧化钠溶液萃取4次,20 ml/次,弃去氯仿液, 合并碱水层, 再加5 mol/L盐酸溶液20 ml, 加氯仿萃取5次,20 ml/次, 合并氯仿液, 加20 ml水洗2次, 氯仿液水浴蒸干, 残渣加甲醇溶解稀释至5 ml, 摇匀, 即得。标准规定应不得检出马兜铃酸A。

1.2.2 试验中发现的问题 用Waters C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)分离, 照上述试验条件, 取上述对照品及供试品溶液各10.00 μl进样, 色谱图中, 在马兜铃酸A峰保留时间附近, 分离出3个峰, 且其中1个峰与马兜铃酸A峰保留时间一致,不借助DAD检测器提取的峰光谱图或质谱检测仪进行区别,结果无法判断。其他色谱条件不变, 改用Gemini C18色谱柱、Shimadzu C18色谱柱及迪马钻石C18柱(规格均为4.6 mm×250 mm,5 μm)三种不同厂家的色谱柱, 结果均只有2个峰,且保留时间与马兜铃酸A不一致。

1.2.3 原标准方法系统适用性验证 本文对原方法做了精密度、稳定性、重现性等试验, 结果表明试验用的高效液相色谱仪和色谱柱均稳定, 对照品溶液和样品溶液均稳定, 供试品的提取处理重现性好。但需分离物质对色谱柱有一定的选择, 待两种物质有的色谱柱能将其分开, 有的则不行。且分离开后, 应对流动相的比例进行适当的调整。

2 结果

2.1 调整流动相 本文尝试改变流动相, 分别以甲醇-3%冰醋酸(68:32)[2], 甲醇-3%冰醋酸(35:65)[3], 乙腈-0.5%冰醋酸(40:60)[4], 乙腈-甲醇-1%冰醋酸溶液(15:15:70)[5],乙腈-0.4%冰醋酸(30:70)为流动相, 流速1.00 ml/min, 以Waters C18柱、Gemini C18柱、Shimadzu C18柱及Dikma 钻石C18柱(规格均为4.6 mm×250 mm,5 μm)进行分离测定, 结果以流动相乙腈-0.4%冰醋酸(30:70), Waters C18柱分离测定结果最好。见图1。同时测定10批样品, 结果均为未检出,重现性好, 准确度高。

2.2 改用二极管陈列检测器 原标准的色谱条件, 用Waters C18柱分离得到的色谱图中可疑峰保留时间虽然与马兜铃酸A保留时间接近, 但通过提取两者光谱图比较, 可疑峰光谱图和对照品并不一致, 这样也能判断为未检出马兜铃酸A。光谱图见图2。

图1 色谱图

图2 光谱图

3 讨论

3.1 根据参考文献和实验, 供试品的制备：经甲醇提取、碱化后用氯仿除去杂质、酸化后氯仿提取, 用甲醇溶解定容,可消除其他物质对马兜铃酸A的干扰[3]。

3.2 因本实验室不具有质谱检测仪, 所以未用LC/MS法来鉴别。如果有质谱检测仪, 可以通过液质联用法做出更准确的定性。有文献记载[6]LC/MS法的测定条件：流动相：乙腈-0.1%甲酸和0.1%四氢呋喃的水溶液；电喷雾离子源(ESI),负离子检测；源电压3.06 kV, 毛细管电压：80 V, 管透镜补偿电压(RF lens)：-0.5 V, 源温度105℃, 锥孔气流：72 L/h。

3.3 建议标准加一条：测定过程中, 如果有阳性结果, 必须用DAD检测器比较光谱图或用液质确认。这样可以准确的判断出结果。

[1]张瑗惠.基层食品药品监督管理局网站建设现状与对策建议研究.山东大学,2013.

[2]朱光辉, 王奇志, 王增寿, 等.反相高效液相色谱法测定甘露消毒丸中马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ的含量.医药导报,2006(6):568-570.

[3]谢昭明, 李顺祥, 刘杰, 等.细辛不同部位马兜铃酸A的含量测定.中成药,2007,29(12):1808-1810.

[4]李庆杰, 刘永强, 常艳茹, 等.清脑止痛胶囊中马兜铃酸A限量测定.特产研究,2009(4):61-64.

[5]陈家煊.跳骨片中马兜铃酸A的HPLC限量检查.海峡药学,2012,24(2):51-53.

[6]张萍, 冉海琳, 肖新月, 等.细辛类植物中马兜铃酸A的定性及定量分析.药物分析杂志,2006,26(6):811-814.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.15.196

2015-03-17]

417000 湖南省娄底市食品药品检验检测所