HPLC-ELSD法测定康复春口服液中黄芪甲苷的含量

李永华

HPLC-ELSD法测定康复春口服液中黄芪甲苷的含量

李永华

目的建立康复春口服液中黄芪甲苷的含量测定方法。方法采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法, 色谱柱：Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm,5 μm), 流动相：乙腈-水(30∶70),流速：0.9 ml/min；柱温：30℃；ELSD参数：漂移管温度70℃, 载气压力：25 kPa, 增益值：3。结果黄芪甲苷在1.05～20.92 μg之间呈良好线性关系, 回归方程为：lnY=1.562lnX+13.506, r=0.9991(n=6)；回收率为93.98%, RSD=1.87%(n=6)。结论本方法简便、准确和重现性好, 可作为康复春口服液的含量测定方法。

康复春口服液；高效液相色谱-蒸发光散射检测法；黄芪甲苷；含量测定

康复春口服液为国家食品药品监督管理局标准收载的品种, 由黄芪、人参、玉竹、蜂王浆等四味中药组成, 具有益气固表、养心安神、健脾和胃等功效。用于心脾俱虚、饮食少思、腹胀腹满、少气乏力、心慌心悸、精神倦怠、失眠。黄芪为方中君药, 具有补气升阳、固表止汗、生津养血作用,而黄芪的主要药理作用成分为黄芪甲苷[1]。原标准采用薄层扫描法对黄芪甲苷进行含量测定, 本文采用HPLC-ELSD法,对黄芪甲苷的含量进行测定, 经方法学考察, 本法简便、准确和重现性均比薄层扫描法要好, 此法可作为康复春口服液中黄芪甲苷的含量测定方法。

1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪, Waters2424型ELSD检测器,1/100000电子天平。黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院, 批号110781-201314, 含量95.8%)；康复春口服液(批号20140721、20140810、20140920, 湖南回春堂药业有限公司生产)。乙腈为色谱纯, 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5μm)；流动相为乙腈-水(30∶70)[1]；流速：0.9 ml/min；柱温：30 ℃；ELSD参数：漂移管温度70 ℃, 载气压力:25 kPa, 增益值：3。

2.2 对照品溶液的制备 称取黄芪甲苷对照品10.95 mg, 置10 ml量瓶中, 加甲醇溶解后稀释至刻度。

2.3 供试品溶液的制备[2]精密吸取本品10 ml, 用三氯甲烷振摇提取2次,30 ml/次, 分取上层溶液, 用水饱和的正丁醇萃取5次,30 ml/次, 合并正丁醇液, 加入氨试液2次,80 ml/次, 合并正丁醇液层, 水浴蒸干, 残渣用甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中, 加甲醇至刻度, 即得供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液的制备 根据处方组成(原药材由湖南回春堂药业有限公司提供)按比例不加黄芪按康复春口服液的制备工艺制备阴性样品, 再按2.3项下的方法制成阴性对照溶液。按上述色谱条件测定, 黄芪甲苷峰与前后峰分离好,且阴性样品溶液在与黄芪甲苷对照品相同保留时间处未显色谱峰, 故认为无干扰。见图1。

色谱图11-黄芪甲苷 A-对照组B-样品C-阴性对照

2.5 标准曲线绘制 分别精密吸取对照品溶液1,2,6,10,15,20 μl, 注入液相色谱仪, 按上述色谱条件进行测定, 以进样量X(μg)的自然对数为横坐标, 峰面积Y自然对数为纵坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程：lnY=1.562lnX+13.506, r=0.9991(n=6)。结果显示, 黄芪甲苷在1.05～20.92 μg呈良好线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液5 μl, 注入液相色谱仪, 连续进样5次, 测定黄芪甲苷的吸收峰面积, RSD=1.85%(n=5)。

2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液20 μl, 在0、2、8、16、24、36、48 h分别进样, 黄芪甲苷峰面积RSD=1.12%(n=7),表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.8 重现性试验 取同一样品(批号20140721)6份,10 ml/份, 按2.3项方法制备溶液, 照含量方法测定, 结果平均含量为0.084 mg/ml, RSD=1.19%。

2.9 加样回收率试验 取已知含量的样品(批号20140721, 0.084 mg/ml), 精密量取6份,5 ml/份, 分别精密加入浓度为1.049 mg/ml的黄芪甲苷对照品0.4 ml, 按2.3项的方法制备溶液, 按照上述方法测定黄芪甲苷的含量, 计算回收率, 结果平均回收率为93.98%, RSD=1.87%(n=6)。见表1。

2.10 样品测定 取3批康复春口服液, 照2.3项下制备供试品溶液, 每批样品制备平行样2份, 进样20.00 μl。含量分别为(批号20140721、20140810、20140920)0.084、0.088、0.089 mg/ml。另采用原标准中的方法测定, 含量分别为(批号20140721、20140810、20140920)0.0459、0.0509、0.0371 mg/ml。

3 小结

3.1 黄芪甲苷无特征紫外吸收, 仅在200 nm处有弱的末端吸收, 需采用紫外末端波长检测[3], 对溶剂要求较高, 试验成本昂贵；且如有其他皂苷类成分的存在时, 干扰严重, 分离度下降, 重现性差, 很难利用HPLC-UV联用测定黄芪甲苷含量。

3.2 原标准采用薄层扫描法对黄芪甲苷进行测定, 但此法受硅胶颗粒细度及薄层板的厚度、活化程度、点样、展开、显色剂量的多少及均匀程度、加热时间等诸多因素影响, 往往需要反复试验, 其准确性、稳定性、精密度很难保证。

3.3 原质量标准中, 供试品溶液的处理还要过D101型大孔吸附树脂柱及用水、40%、70%乙醇洗涤, 本法省去上述步骤, 实验表明黄芪甲苷分离效果也很理想, 且加样回收率也比较好。

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典.一部.北京：中国医药科技出版社,2010:284.

[2]朱克旭, 李永宏, 刘冰冰. HPLC-ELSD法测定芪心合剂中黄芪甲苷的含量. 安徽医药,2011,15(11):1364-1365.

[3]钱广生, 刘三康, 李章万. HPLC测定黄芪注射液中黄芪甲苷的含量. 华西药学杂志,2002,17(1):41-42.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.15.197

2015-03-30]

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