桦褐孔菌菌丝体液体培养条件的优化1)

2015-03-07毛庆莲刘雪峰董爱荣宋庆超

东北林业大学学报 2015年11期

毛庆莲刘雪峰董爱荣宋庆超

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (大兴安岭地区塔河林业局绣峰林场)

责任编辑:程红。

桦褐孔菌(Ⅰnonotus obliquus)属真菌门(Eumycota)担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲(Hymenomycetes)非褶菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)纤孔菌属［1］，俗称桦癌褐孔菌、白桦茸、斜管纤孔菌，欧洲人称之为chaga［2］，是一种药用价值很高、应用前景广泛的真菌，可用于治疗各种消化道癌症、降血糖、防治艾滋病、抗衰老、降血脂、降血压，还能够改善过敏体质，增强免疫力［3］。桦褐孔菌主要寄生于白桦(Betula platyphylla)、银桦(Grebillea robusta)、榆(Ulmus pumila)、赤杨(Alnus japonica)等落叶树活立木的树皮下或倒木枯干上，形成不育的木腐菌。其菌核可以在砍伐后的枯干上生存6年之久，菌丝体耐受低温能力极强，主要分布于北纬45°～50°地区的苦寒地带，如俄罗斯，中国黑龙江大小兴安岭、吉林省长白山，北美北部及日本北海道［4-5］。由于桦褐孔菌生长环境特殊，自然资源十分有限，子实体人工栽培困难，运用发酵工程技术生产菌丝体，为研究和开发桦褐孔菌食品、保健品和药品提供充足的原材料具有重大的现实意义［6］。本研究对桦褐孔菌菌丝体液体培养条件进行了研究，为进一步规模化发酵生产桦褐孔菌菌丝体提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

采自黑龙江省大兴安岭呼中国家级自然保护区白桦林的野生桦褐孔菌子实体，采用伞菌分离法，分离获得纯菌种，根据子实体、菌丝体生长特征，鉴定为桦褐孔菌。

1.2 菌丝体生物量的测定

将在PDA 固体培养基上培养7 d 的菌种用打孔器转接至PDA 液体培养基里，装液量250 mL 摇瓶装100 mL 培养基，28 ℃、120 r·min-1摇床培养7 d。摇培结束后将培养液离心取菌丝体，菌丝体经去离子水水洗，再离心，这样重复操作几次，收集菌丝体，研磨过筛待测。

1.3 菌丝体多糖的测定

将干燥至质量恒定的桦褐孔菌菌丝体，粉碎成粉末过60 目筛，取100 g 样品用95%乙醇溶液回流提取3 h，滤液倒掉，重复提取3 次，除去样品中的生物碱、色素、多酚类和低聚糖，弃滤液，烘干滤渣。处理后的滤渣按料液比1 ∶40 加水，待水浴锅温度升至45 ℃时，加入400 U·g-1纤维素酶和600 U·g-1中性蛋白酶，在功率125 W、温度55 ℃的超声提取器中作用2 h，升温至80 ℃灭酶，并在此温度条件下恒温浸提3 h 后，合并滤液，旋转蒸发仪减压回收，加95%乙醇溶液沉至乙醇终体积分数80%，离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚、丙酮交替洗涤2 次，干燥得总多糖［7］。

1.4 单因素梯度法优化液体培养条件

选用不同碳源、氮源、温度、初始pH、摇床转速，进行单因素梯度试验，测定桦褐孔菌菌丝体生长的情况，以菌丝体生物量和多糖产量为指标，优化桦褐孔菌菌丝体培养条件。

碳源对菌丝生长的影响:在基础培养基中，将碳源分别以25 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉5 个不同处理取代，其他条件不变，同一处理重复3 次，同时进行空白对照，测定桦褐孔菌菌丝生物量和多糖产量。

氮源对菌丝生长的影响:在基础培养基中，将氮源分别以15 g·L-1蛋白胨、酵母粉、豆饼粉、尿素、硫酸铵5 个不同处理取代，其他条件不变，同一处理重复3 次，同时进行空白对照，测定桦褐孔菌菌丝生物量和多糖产量。

温度对菌丝生长的影响:在基础培养条件下，分别设定22、24、26、28、30、32 ℃这6 个梯度温度处理，其他条件不变，同一处理重复3 次，同时进行空白对照，测定桦褐孔菌菌丝生物量和多糖产量。

初始pH 值对菌丝生长的影响:在基础培养条件下，分别设定5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5 这6 个梯度pH 处理，其他条件不变，同一处理重复3 次，同时进行空白对照，测定桦褐孔菌菌丝生物量和多糖产量。

摇床转速对菌丝生长的影响:在基础培养条件下，分别设定100、110、120、130、140、150 r·min-1这6 个梯度转速处理，其他条件不变，同一处理重复3 次，同时进行空白对照，测定桦褐孔菌菌丝生物量和多糖产量。

2 结果与分析

2.1 最佳碳源的确定

由表1可见，桦褐孔菌能利用供试的5 种碳源，以葡萄糖为碳源时，多糖产量最高，为37.42 mg/L，其次分别是蔗糖、玉米粉、麦芽糖等，而以玉米粉为碳源时，其菌丝生物量最高，为5.49 g/L，其次为葡萄糖(4.62 g·L-1)、蔗糖(4.35 g·L-1)。玉米粉作为价格低廉的农副产品在应用于工业生产较为合适，但在实验室培养中其作为复杂的复合碳源会带来其他影响。综合考虑，选择葡糖糖作为液体培养的最适碳源。

2.2 最佳氮源的确定

由表2可以看出，桦褐孔菌5 种氮源中均能生长，但由于有机氮源富含各种可以被直接吸收的氨基酸，利于菌丝体生长，故其对蛋白胨、酵母粉、豆饼粉的利用明显好于尿素、硫酸铵等无机氮源。以蛋白胨为氮源时，多糖产量最高，为32.62 mg·L-1，此时菌丝生物量也最高，为4.45 g·L-1，其次分别为豆饼粉、酵母粉，同时蛋白胨可充当生长因子，缩短培养周期，故选择蛋白胨作为最适氮源。

表1 碳源对桦褐孔菌多糖产量和菌丝生物量的影响

表2 氮源对桦褐孔菌多糖产量和菌丝生物量的影响

2.3 最适温度的确定

由表3可见，桦褐孔菌在22～32 ℃均可以生长。从22 ℃开始菌丝生物量逐渐增加至28 ℃达到最大值(4.15 g·L-1)，而后随温度升高菌丝生物量明显降低，而多糖产量则在26 ℃达到最高，为28.85 mg·L-1，随后降低。综合考虑多糖产量和菌丝生物量的指标选择27 ℃为最适培养温度。

表3 温度对桦褐孔菌多糖产量和菌丝生物量的影响

2.4 最适初始pH 值的确定

从表4可以得出，在设定的6 个梯度pH 范围内，桦褐孔菌菌丝体均可以生长。当pH 值为6.5时，菌丝生物量达到最高为3.84 g·L-1，随着pH 继续增加菌丝生物量下降，说明接近自然pH 值比较适合菌丝体生长。而多糖产量在pH 值小于8.5 时，随其增加而增多，pH 值8.5 时达到最大，为24.11 mg·L-1，随后再增加pH 值，多糖产量大幅度下降，说明多糖的培养适合在中性偏碱条件下生长。综合考虑多糖产量和菌丝生物量标准，最终确定pH7.5为最适培养pH。

2.5 最适摇床转速的确定

由表5可知，当摇床转速在100～130 r·min-1，菌丝生物量随转速增加而增加，130 r·min-1时菌丝生物量达到最大值(3.66 g·L-1)，而此时多糖产量也达到最高(22.89 mg·L-1)，继续增加转速，菌丝生物量与多糖产量同时缓慢降低。故确定最适摇床转速为130 r·min-1。