响应面法优化水提铜色牛肝菌多糖工艺*

王心诗，邰丽梅，吴素蕊**，赵天瑞

（1.昆明理工大学云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

响应面法优化水提铜色牛肝菌多糖工艺*

王心诗1，邰丽梅2，吴素蕊2**，赵天瑞1

（1.昆明理工大学云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

针对野生铜色牛肝菌多糖的提取，通过单因素试验选取试验因素与水平，根据Box-Behnken的中心组合试验设计及响应面法分析建立二次回归模型，对提取温度、提取时间和料液比进行优化组合。结果表明，多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度49℃、提取时间3.6 h、料液比1∶40。在此最佳工艺条件下，野生铜色牛肝菌多糖得率为14.92%。

铜色牛肝菌；响应面法；多糖；提取工艺

真菌多糖（Fungus polysaccharide） 一般是指从真菌的子实体、菌丝体及发酵液中分离出的，由10个以上单糖以糖苷键结合而成的天然高分子聚合物，是一种特殊的生物活性物质，在人体内起着非常重要的作用。大量的动物和临床研究表明，真菌多糖具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗溃疡、抗凝血、增强免疫力等，在国际上被称为“生物反应调节剂”[1-3]。我国丰富的食用菌天然资源和悠久的食用菌栽培、应用历史，对于食（药）用菌多糖的研究与药品、保健品的开发利用有着得天独厚的优势[4]。随着人们对食用菌多糖活性成分功能、营养的深入研究和提取工艺的不断完善，食用菌多糖将在医药、保健品、食品、饮料以及其他领域得到越来越广泛的应用[5]。

铜色牛肝菌（Boletus aereus） 又名黑牛肝菌，属于牛肝菌属[6]，是一种可食用的蘑菇，营养成分丰富，具有“高蛋白、低脂肪、低热量”等特点[7]。我国主要分布在四川、贵州、云南等地，国外主要分布在欧洲各国[8]，在巴斯克地区和意大利经常被拿来食用，具有良好的食用和药用价值。目前，铜色牛肝菌多以鲜食为主，深加工及对功能性成分分离利用的研究还不够深入，因此有必要开展对铜色牛肝菌多糖的研究。

本文利用热水浸提法提取野生铜色牛肝菌多糖，并且通过单因素试验及Box-Behnken中心组合试验设计、响应面分析法[9]，优化多糖的提取工艺，为这一野生铜色牛肝菌资源的综合开发及利用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料：野生铜色牛肝菌，购自云南省易门县农贸市场，冻藏备用。

试剂：葡萄糖、硫酸、苯酚、无水乙醇、丙酮，均为分析纯。

仪器：高速多功能粉碎机（Q-250B3），上海冰都电器有限公司；电子天平（AL204），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4），金坛市科析仪器有限公司；循环多用真空泵SHZ-D（Ⅲ），巩义市子华仪器有限责任公司；旋转蒸发仪（OSB-2100），上海爱朗仪器有限公司；双束紫外可见分光光度计（TU1901），北京普析通用仪器有限责任公司；大容量离心机（LXJ-ⅡB），上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖的提取

铜色牛肝菌前处理：将筛选、清洗、除杂后的铜色牛肝菌烘干，粉碎过80目筛备用。

水提铜色牛肝菌多糖：准确称取过筛后的铜色牛肝菌粉末0.5 g，按一定料液比、温度和时间提取多糖。水提结束后，真空抽滤，滤液真空浓缩至原体积1/4，加4倍体积的95%乙醇静置过夜。于5 000 r·min-1离心15 min，弃上清液，沉淀用80%乙醇洗3遍，再用丙酮洗2遍，真空干燥后得粗多糖样品[10]。进行平行试验3次。

1.2.2 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[11]。

1.2.3 多糖得率的计算

采用重量法[12]测定，铜色牛肝菌多糖得率（Y）公式为：式中：m1表示铜色牛肝菌多糖质量；m2表示铜色牛肝菌质量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对多糖提取率的影响

确定水浴时间3 h，料液比1∶40（g∶mL），研究提取温度对多糖得率的影响，结果如图1所示。

图1 提取温度对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

由图1可知，在温度30℃～50℃，随温度升高，多糖提取率增加明显；当温度超过50℃，随着温度上升，多糖提取率明显下降。这与多糖本身的结构及活性有关，3 h的高温浸提可能会导致多糖的分子结构降解，提取率降低[13-14]。由此可见，浸提温度不宜太高，50℃为最适提取温度。

2.1.2 提取时间对多糖提取率的影响

提取温度50℃、料液比1∶40（g∶mL）时，研究不同提取时间对多糖得率的影响，结果如图2所示。

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

由图2可知，随浸提时间的延长，多糖提取率不断增加，3 h～3.5 h提取率显著增加；3.5 h以后，随着时间增加，提取率趋于平缓，几乎持平。多糖提取率与时间有密切关系，提取时间过短，铜色牛肝菌中的多糖无法充分溶出，影响提取效率；时间过长，可能会使部分已经溶出的多糖在长时间高温环境下发生结构变化，提取率降低[15]。因此，综合考虑效率、能耗因素，选择浸提时间为3.5 h。

2.1.3 料液比对多糖提取率的影响

在提取温度50℃、提取时间3.5 h条件下，研究料液比对多糖得率的影响，结果如图3所示。

图3 料液比对多糖提取率的影响Fig.3 Effectofsolid-to-liquidratioonpolysaccharideextractionrate

由图3可知，随着料液比的提高，多糖提取率先增加后减小。在料液比为1∶10～1∶30这个阶段时，多糖提取率呈增加趋势，并且在料液比1∶40时达到最大；在料液比为1∶40之后，提取率明显下降，这说明在料液比为1∶40时，有效成分提取较充分。溶剂用量与多糖的溶出存在对应的平衡关系，即有一个饱和溶出度的问题。若继续提高料液比，会增加能量的消耗，延长浓缩的时间，损失量相对也会增加[16-17]。因此，确定1∶40为最佳料液比。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

通过单因素试验，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理[18-20]，进行三因素三水平试验优化多糖提取工艺。响应面试验因素与水平见表1。

表1 试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of the experiment

试验设计及结果见表2。如表2所示，析因试验的试验号为1号～12号，零点试验的试验号为13号～15号，其中自变量取值在A、B、C构成的三维顶点为析因点；区域中心点为零点，重复零点试验3次，估计试验误差。

拟合得到多糖得率的预测值对各因素的回归方程为：

Y=14.98-0.45A+0.18B+0.023C-0.41AB+0.024AC -（1.275E-003）BC-2.51A2-1.09B2-0.83C2。对回归模型进行方差分析，结果见表3。

表2 试验设计与结果Tab.2 Experimental design and yield

由表3可知，各因素和响应值之间线性关系显著，试验误差较小，模型方差可较好地反应真实试验值。该模型R2=0.9984，表明试验方法可靠；R2Adj= 0.9955，变异系数CV/%=0.78，表明多糖提取率模型拟合性好，可用于预测提取铜色牛肝菌多糖的工艺试验结果。模型的P值小于0.0001，铜色牛肝菌多糖提取率的回归模型结果极为显著。失拟项F值为3.18，模型计算结果与检验结果的差异不显著。由表3中P值可知，A、B、AB、A2、B2、C2对多糖提取率有显著影响，且各试验因子对响应值不是简单的线性关系。

图4、图5、图6为各因子交互作用三维响应面曲面图和等高线图。由图4可知，在相同提取时间，随着提取温度升高，得率呈现先增加后减小的趋势；在提取温度一定时，随提取时间延长，得率呈逐渐增加趋势，这与单因素试验结果一致。另外，提取时间与提取温度之间的交互作用对铜色牛肝菌多糖得率有显著影响，且提取温度影响的显著性大于提取时间。由图5可知，提取温度与料液比的交互作用较显著，提取温度对试验结果影响的显著性大于料液比。由图6可知，提取时间与料液比的交互作用不显著，且提取时间影响的显著性大于料液比。比较3组图可知，提取温度对铜色牛肝菌多糖提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡，提取时间的影响较为显著，而料液比的影响不显著，表现为曲线较为平滑。3个因素对多糖提取率的影响及各个因

素间的交互影响与回归分析结果吻合。

表3 回归模型方差分析结果Tab.3 Results of variance analysis of regression model

图4 提取温度与时间及其相互作用对多糖提取率影响的响应曲面和等高线Fig.4 Response surface and contours of the effect of temperature and time on polysaccharide extraction rate

图5 提取温度与料液比及其相互作用对多糖提取率影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface and contours of the effect of temperature and solid-to-liquid ratio on polysaccharide extracting rate

2.2.2 响应面分析检验

根据上述优化条件得到最佳提取工艺条件：提取温度49.01℃、提取时间3.55 h、料液比1∶40.12，通过回归方程得出预测值为15.0155%。考虑实际操作可行性，将多糖的提取条件修正为：提取温度49℃、提取时间3.6 h、料液比1∶40。进行3次平行验证试验，多糖的平均得率为14.92%，与预测值相差0.096%，说明该方程与实际情况拟合较好，充分说明了采用响应面优化的提取条件准确可靠，能用于指导铜色牛肝菌多糖的提取。

图6 提取时间与料液比及其相互作用对多糖提取率影响的响应曲面和等高线Fig.6 Response surface and contours of the effect of time and solid-to-liquid ratio on polysaccharide extracting rate

3 结论

在单因素试验的基础上，通过响应面法优化水提铜色牛肝菌多糖的工艺，最佳提取工艺为：提取温度49℃、提取时间3.6 h、料液比1∶40，在此条件下铜色牛肝菌多糖得率为14.92%。

[1]王思芦，汪开毓，陈德芳.食用菌多糖免疫调节作用及其机制研究进展 [J].动物医学进展，2012，33（11）：104-108.

[2]李小雨，王振宇，王璐.食用菌多糖的分离、结构及其生物活性的研究进展 [J].中国农学通报，2012，28（12）：236-240.

[3]王一心，李平.食用菌的营养成分及药理作用研究进展[J].大理医学院学报，2001，10（4）：63-65.

[4]唐鹏，李学英，王大忠.食用菌多糖药理作用研究进展[J].临床合理用药杂志，2014，7（6B）：176-178.

[5]刘浪浪，刘伦，刘军海.食用菌多糖研究热点及发展趋势[J].化工科技市场，2009，32（7）：37-40.

[6]李泰辉，宋斌.中国食用牛肝菌的种类及其分布 [J].食用菌学报，2002，9（2）：22-30.

[7]周玲仙，殷建忠.云南野生食用牛肝菌营养成分分析及评价 [J].食用菌，2008，30（4）：61-62.

[8]上海农业科学院食用菌研究所.中国食用菌志 [M].北京：中国林业出版社，1991：195-196.

[9]杨文雄，高彦祥.响应面法及其在食品工业中的应用 [J].中国食品添加剂，2005（2）：68-71.

[10]王峰.三种食用菌多糖提取分离及降血糖和抗氧化作用的研究 [D].南京：南京师范大学，2009.

[11]Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances [J].Anal Chem,1956,28（3）:350-356.

[12]郝晓宏，韩琼.水溶性多糖3种测定方法的探讨 [J].山西职工医学院学报，2003（1）：2-4.

[13]韩冰，李全宏.花生多糖的提取工艺优化及抗氧化活性[J].食品研究与开发，2010，31（12）：54-58.

[14]高丹丹，安文强，陈红.响应面法优化兰州百合多糖的提取工艺 [J].食品工业科技，2013，34（5）：99-105.

[15]蒋水星，陈雪峰，赵天殊.响应面法优化大枣多糖的提取工艺研究 [J].安徽农业科学，2011，39（6）：3652-3654.

[16]魏桢元，钟耀广，刘长江.响应面优化法对香菇多糖提取的工艺研究 [J].辽宁农业科学，2010（2）：11-14.

[17]张永军，刘晓宇，黄惠华.响应面法优化葛根多糖提取工艺的研究 [J].现代食品科技，2008，24（7）：678-682.

[18]费荣昌.试验设计与数据处理（第四版） [M].无锡：江南大学出版社，2001：59-63.

[19]董万领，闫晓明，程江华，等.响应面法优化水提菜籽多糖工艺 [J].中国油脂，2014（14）：87-89.

[20]Box GEP,Hunter WG.Statistics for experiments:an introduction to design,data analysis and model building[M]. New York:Wiley,1990：225-287.

Optimization of the Extraction Technique of Boletus aereus Polysaccharide via Response Surface Analysis

WANG Xin-shi1,TAI Li-mei2,WU Su-rui2,ZHAO Tian-rui1
（1.Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 2.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives,Kunming 650221,China)

In this paper,aiming at the extraction of Boletus aereus,experiment factors and levels were firstly selected by onefactor tests.The optimum extraction conditions for extraction temperature and time,solid-to-liquid ratio were studied according to the mathematics model built by using Box-Behnken central composite design and response surface methodology(RSM).The results showed that the optimum conditions of Boletus aereus extraction were:extraction temperature of 49℃,extraction time of 3.6 h and ratio of material to water of 1∶40,then the yield rate of Boletus aereus was 14.92%.

response surface methodology;Boletus aereus;polysaccharides;extraction technology

S646.9

A

1003-8310（2015）01-0060-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.017

国家科技支撑计划课题（2012BAD36B02）。

王心诗（1989-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为食品储藏与加工方向研究。

**通信作者：吴素蕊（1979-），女，硕士，副研究员，主要从事食用菌科学与工程研究。

2014-11-10