不同溶剂的食用菌提取液对烟草病原菌的抑制作用*

钟永丽，高现亮，罗华元，王 娜，董石飞，王伟丹，饶 智，王丽萍，兰建强,**

(1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；2.红云红河烟草（集团）有限责任公司,云南 昆明 650231；3.云南农业大学烟草学院，云南 昆明 650201）

不同溶剂的食用菌提取液对烟草病原菌的抑制作用*

钟永丽1，高现亮1，罗华元2，王 娜3，董石飞2，王伟丹1，饶 智2，王丽萍3，兰建强1,3**

(1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；2.红云红河烟草（集团）有限责任公司,云南 昆明 650231；3.云南农业大学烟草学院，云南 昆明 650201）

采用滤纸圆片法和试管二倍稀释法研究了食用菌的不同溶剂提取液对烟草3种致病菌异丝腐霉、黑胫病菌、青枯病菌的抑菌作用。结果表明，乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷4种溶剂提取10种食用菌得到的提取液，对烟草异丝腐霉菌和黑胫病菌的菌丝生长均未表现出明显的抑制效果，而对烟草青枯病菌的抑制作用有明显差异。4种溶剂提取液对受试菌的抑菌浓度（MIC）范围在0.03 mg·mL-1～7.63 mg·mL-1之间；抑菌能力大小顺序为三氯甲烷提取液＞乙醇提取液＞乙醚提取液≥丙酮提取液。

食用菌；溶剂；病原菌；抑制

食用菌是一类可供食用、子实体硕大的高等真菌。中国已知的食用菌350多种，大多属于担子菌亚门，常见的有香菇、猴头、木耳、银耳、牛肝菌、竹荪等；少数属于子囊菌亚门，如羊肚菌、马鞍菌、块菌。食用菌蛋白质含量高，脂肪含量低，维生素种类齐全，矿物质含量丰富，不含淀粉，具有很高的营养价值。食用菌还含有多糖、甾体、嘌呤等对人体起保健作用的有益成分[1]。

食用菌除具有极大的营养价值和药用价值外，其抑菌作用逐渐成为新的研究热点。目前研究主要集中在食用菌水提物、有机溶剂提取物、食用菌发酵液，越来越多食用菌对人类疾病病原菌、植物病害病原菌、食物腐败菌抑制作用的研究被报道。研究表明，食用菌含有的一些活性成分对某些种类的微生物有一定的抑制作用。马学萍等[2]测试了8种食用菌提取物在体外对烟草花叶病毒的钝化、预防、治疗效果，推测提取物中可能含有小分子抗病毒活性物质。吴丽萍等[3]研究发现金针菇、木耳和平菇提取液对西瓜炭疽（Colletotrichum orbiculareArx）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的菌丝生长有一定的抑制活性。刘莹[4]采用K-B法进行的体外抗菌活性研究表明，3种食用菌粗多糖对革兰氏阴性菌的大肠杆菌、沙门氏菌及革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌都有抑制性，且抑菌活性都随着浓度的升高而增强。姜丽等[5]研究发现木蹄层孔菌Fomes fomentarius（L.: Fr.） Kick.子实体的不同溶剂提取物对白色念珠菌JLC31680、白色念珠菌 JLC31681、大肠杆菌ATCC8099、金黄色葡萄菌ATCC6538均有不同程度的抑制作用。宁安红等[6]研究发现筛选出的香菇C91-3菌的深层发酵液对革兰氏阴性菌的抑制作用明显，对革兰氏阳性菌无效。有研究表明，虎奶菌乙酸乙酯发酵液对革兰氏阳性菌的抑制效果显著高于几种食品防腐剂[7]。不同品种的食用菌由于产地和所处的生态地理环境不同，其所含的有效抑菌成分的种类和含量差别较大。云南省食用菌资源丰富，作为新型植物源杀菌剂先导物的开发潜力非常大。本实验室高现亮等[8]已初步研究了11种食用菌水提液对异丝腐霉菌、黑胫病菌、青枯病菌的抑制作用，均表现出一定的抑制活性。鉴于同一种食用菌不同提取方式的抑菌物质活性不一样，本实验使用4种不同有机溶剂对10种不同食用菌进行提取，并进一步探究其提取液对3种重要烟草病原菌的抑菌效果，旨在找到一种能获得高抑菌活性成分的提取液溶剂，为研制开发高效、低毒、无残留、无污染的植物源杀菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试品种和菌株

红葱（E.americanaMerr.ex Heyne）、黑牛肝（Boletus aereusFr.ex Bull.）、香菇（Lentinus edodes）、块菌 （Tuber melanosporum）、美味牛肝菌（Boletus edulisBull.ex Franch）、黄牛肝 [Termitomyces eurrhizus(Berk.)Heim]、奶浆菌（Lactarius volemus）、大红菇（Russula alutaceaFr.）、虎掌菌（Sarcodon imbricatus） 和青头菌 [Russula virescens（Schaeff.）ex Zanten Fr.]10种食用菌干样，购自云南昆明木水花野生菌批发市场。烟草异丝腐霉病菌（Pythium diclinumTokunaga in Ito&Tokunaga）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum） 和黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae） 由本实验室培养保存。

1.2 培养基及主要试剂

烟草异丝腐霉病菌、黑胫病菌的培养及生长抑制试验采用燕麦培养基；青枯病菌的培养，用牛肉浸膏琼脂培养基，生长抑制试验采用TTC琼脂培养基，最低抑菌浓度（MIC）的测定采用TTC液体培养基[9]。提取活性成分所用的有机溶剂为无水乙醇、三氯甲烷、乙醚、丙酮，4种试剂均为分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司生产。烘箱、搅拌机、粉碎机、索氏提取器由本实验室提供。

1.3 活性成分的提取

将10种食用菌子实体去杂、洗净，65℃烘干，粉碎备用。称取各子实体粉5 g，用滤纸包裹起来，线扎实，置于索氏提取器。采用回流提取6 h进行提取，提取完成后，250 mL烧瓶里的溶液定容至20 mL。提取器里的固体风干后称重，所得提取液置于4℃冰箱备用。

提取液浓度等于提取前粉末重量与提取后干粉重量之差除以定容的体积。

1.4 菌液的制备

将所有供试菌活化2代后，分别接入试管斜培养基，32℃恒温培养18 h～24 h。试验时分别取各供试菌株的培养物适量接种于TTC液体培养基内，32℃培养16 h～18 h，采用10倍稀释法，用生理盐水稀释至10 000倍备用。

1.5 滤纸片法测定抑菌效果

1.5.1 病原真菌菌丝生长抑制定性实验

使用直径0.8 cm的打孔器在滤纸片上打小圆片，试管中进行密封灭菌。无菌条件下，分别将圆片滤纸置于不同溶剂食用菌提取液中浸渍24 h，以提取液溶剂浸渍为对照。用打孔器在已活化的菌株平板中打菌柄，取1块转入燕麦培养基平板中央。圆片滤纸取出，吸干多余水分，置于平板中央距菌柄2 cm~3 cm处，每皿等距放置3片。28℃恒温培养2 d~3 d，观察滤纸圆片周围抑菌圈的有无及大小。

1.5.2 病原细菌生长抑制定性实验

使用直径0.8cm的打孔器在滤纸片上打小圆片，试管中进行密封灭菌。无菌条件下，滤纸片每3个为一组放入不同溶剂食用菌提取液中浸渍24 h，以提取液溶剂浸渍为对照。将配制好的一定浓度的青枯病菌菌悬液0.2 mL，均匀涂布到TTC琼脂培养基平板上，待风干后，将不同提取液浸泡的圆片滤纸等距置于平板上，每皿3片。32℃恒温培养48 h，观察滤纸片周围抑菌圈有无及其大小。

1.6 最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用二倍稀释法测定食用菌提取液对烟草青枯病菌生长的最低抑菌浓度。将青枯病菌配制成一定浓度的菌悬液。取无菌试管（10mL）若干，排成一排，在各试管中加入1 mLTTC液体培养基，然后在第一支试管中加入1 mL食用菌有机溶剂提取液，混匀，依次从前一支试管中取1 mL混合液加入后一支试管，所得到的浓度为前一支的二分之一。再吸取配置好的一定浓度的青枯病菌菌悬液0.25 mL加入各试管中，封口置于32℃的恒温培养箱中培养48 h后，观察各试管中颜色变化。

1.7 数据统计分析

实验数据采用Microsoft Excel 2010处理，采用DPS 6.55版本进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 4种不同溶剂提取10种食用菌得到的提取液对供试菌株的抑制效果

采用生长速率法和抑菌圈法测定抑菌作用的实验中，各提取液对供试菌株的抑制效果见表1～表3。

（续表1）

表2 不同有机溶剂的食用菌提取液对烟草黑胫病菌丝生长的抑制效果Tab.2 Inhibitingeffectsofdifferentmushroomextractsbydifferentorganicsolventsonhyphaegrowthof Phytophthoraparasitica var.nicotianae

（续表2）

表3 不同有机溶剂的食用菌提取液对烟草青枯病菌的抑菌效果Tab.3 Inhibiting effects of different mushroom extracts by different organic solvents on Ralstonia solanacearum

从表1～表3可以看出，用4种不同溶剂提取10种食用菌得到的提取液抑菌效果不同，同一种食用菌的不同溶剂提取液的抑菌效果也不同。不同溶剂提取液对烟草异丝腐霉菌和黑茎病菌的菌丝生长均未表现出明显的抑制效果，而对烟草青枯病菌的抑制作用有明显的差异。其中，使用三氯甲烷提取的10种食用菌提取液对烟草青枯病菌抑制效果显著，以奶浆菌提取液的抑制作用最好，抑菌圈直径为1.78 cm；使用乙醚提取的10种食用菌提取液中，黑牛肝、块菌、美味牛肝菌、虎掌菌、青头菌提取液对烟草青枯病菌有明显的抑制作用；无水乙醇提取液对烟草青枯病菌的抑制作用次之；丙酮提取液对烟草青枯病菌未表现出抑制活性。

2.2 4种不同有机溶剂的食用菌提取液对烟草青枯病菌的最低抑菌浓度（MIC）

4种不同溶剂提取10种食用菌得到的提取液对青枯病菌的最低抑菌浓度测定结果见表4。

从表4得知，4种不同有机溶剂提取10种食用菌得到的提取液对烟草青枯病菌的抑制作用有明显的差异。4种溶剂提取10种食用菌得到的提取液对供试菌的抑菌浓度（MIC）范围在0.03 mg·mL-1~7.63 mg·mL-1之间；抑菌能力大小顺序为三氯甲烷提取液＞乙醇提取液＞乙醚提取液≥丙酮提取液。不同溶剂的提取液抑菌活性有差异，其中以三氯甲烷、乙醇溶剂的提取液抑菌效果最理想，其次为乙醚提取液，丙酮提取液无抑菌活性。

表4 不同有机溶剂的食用菌提取液对烟草青枯病菌的最低抑菌浓度（MIC）Tab.4 The minimal inhibitory concentrations(MIC)of different mushroom extracts by different organic solvents on Ralstonia solanacearum

3 讨论

食用菌抑菌效果既与提取物的浓度有关，与提取溶剂、方法也有一定的相关性。郝景雯等[10]对长裙竹荪水提物和乙醇提取物的抑菌活性进行比较，发现水提物对各供试菌均未显现出明显抑制作用，而乙醇提取物的抑菌作用十分显著。食用菌中含有的活性物质对温度有一定的敏感性。金针菇提取液经高温处理后对西瓜炭疽菌的活性降低，对辣椒疫霉菌反而有促进作用[3]。檀东飞等[11]在关于棘托竹荪乙酸乙酯提取物抑菌作用的报道中指出，该菌提取物对蛋白质类食物的防腐效果80℃提取物比常温的好。

本试验通过对10种食用菌4种不同溶剂的提取液抑菌活性进行比较，结果表明，各提取液对烟草异丝腐霉菌和黑茎病菌的菌丝生长均未表现出明显的抑制效果，对烟草青枯病菌的有一定的抑制作用，且抑制强度有显著性差异。对烟草青枯病菌抑制效果较好的抑菌物质主要集中在三氯甲烷和无水乙醇提取液中，尤其是三氯甲烷提取液的抑菌活性最高。有研究表明，提取溶剂对竹荪抑菌效果的影响大于打浆时间、浓缩程度、浸提温度[12]。郝景雯等[10]的研究也证实不同溶剂的提取液抑菌活性存在一定差异。据此可以推测以上10种食用菌含有的抑菌活性物质为极性大小不一样的小分子化合物，不同极性的溶剂对他们的溶解度不一样，且这些活性成分对不同病原菌的作用机理不一样，导致抑菌活性存在差异。因此，选择合适的提取溶剂是获得食用菌有效活性成分的关键。此外，本试验还测定了不同溶剂的食用菌提取液对烟草青枯病菌的最低抑菌浓度，为进一步提取、纯化抑菌活性成分并对其抑菌机制进行研究提供理论依据。

[1]乔德生，王玉彦，邹向英，等.浅谈食用菌的营养特点与药用价值 [J].滨州职业技术学院学报，2005，2（4）：67-69.

[2]马学萍，段云晖，孔宝华，等.食用菌提取物对烟草花叶病毒的抑制作用 [J].云南农业大学学报，2007，22（2）：296-298.

[3]吴丽萍，袁建赣，李飞，等.4种食用菌提取物对2种植物病原真菌的抑菌作用 [J].安徽农业科学，2009，37（8）：3587-3589.

[4]刘莹.三种食用菌粗多糖体外抗菌活性的研究 [J].食用菌，2009（2）：66-68.

[5]姜丽，包海鹰.木蹄层孔菌子实体提取物体外抑菌活性研究 [J].中国食用菌，2011，30（2）：39-43.

[6]宁安红，曹婧，黄敏，等.香菇C91-3菌发酵液的抑菌作用的初步探讨 [J].中国农业科技导报，2006，8（6）：17-19.

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[8]高现亮，罗华元，梅友坤，等.多种食用菌粗提液对烟草病原菌的抑制效果 [J].中国食用菌，2014，33（3）：34-37.

[9]方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998

[10]郝景雯，贾士儒，张刚.长裙竹荪乙醇提取物与水提取物抑菌作用研究 [J].食品研究与开发，2010，31(10)：8-9.

[11]檀东飞，苏燕卿，吴若菁，等.棘托竹荪乙酸乙酯提取物的抑菌作用研究 [J].海峡药物，2002，14(5)：101-103.

[12]谭敬军，胡亚军，吴晗晗.竹荪抑菌作用研究 [J].食品科学，2000，21(10)：54-56.

Inhibiting Effects of Mushroom Extracts by Different Solvents on Tobacco Pathogens

ZHONG Yong-li1,GAO Xian-liang1,LUO Hua-yuan2,WANG Na3,DONG Shi-fei2, WANG Wei-dan1,RAO Zhi2,WANG Li-ping3,LAN Jian-qiang1，3
(1.College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Hongyun-Honghe Group Co.Ltd., Kunming 650231,China;3.College of Tobacco,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

The inhibiting effects of mushroom extracts by different solvents on three kinds of plant pathogens,Pythium diclinum Tokunaga in Ito&Tokunaga,Phytophthora parasitica var.nicotianae and Ralstonia solanacearum in tobacco were studied by filter paper disc method and the tube double dilution method.The results showed that 10 different edible mushroom extracts obtained by 4 different organic solvents including ethanol,acetone,diethyl ether,trichloromethane had no certain inhibiting effects on Pythium diclinum Tokunaga in Ito&Tokunaga,Phytophthora parasitica var.nicotianae in tobacco,while the inhibiting effects on Ralstonia solanacearum in tobacco were different significantly.The minimal inhibitory concentrations(MIC)of extracts on Ralstonia solanacearum ranged form 0.03 mg·mL-1to 7.63 mg·mL-1.Antibacterial activity was in this order:trichloromethane extract＞ethanol extract＞diethyl ether extract≥acetone extract.

edible mushroom;solvents;pathogen;inhibitory

S646.9

A

1003-8310（2015）01-0044-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.013

云南中烟资助项目（2011JC-2）。

钟永丽（1988-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为生物农药开发。E-mail:zhongyl21@126.com

**通信作者：兰建强（1962-），男，博士，教授，主要从事烟草病害防治和生物农药开发研究。E-mail:jqlan92@163.com

2014-10-17