细胞因子信号转导抑制因子3在早产胎盘中的表达及临床意义

温　娜,张巧玉,王振国

(解放军第三〇九医院妇产科，北京 100091)



细胞因子信号转导抑制因子3在早产胎盘中的表达及临床意义

温娜,张巧玉,王振国※

(解放军第三〇九医院妇产科，北京 100091)

摘要：目的探索细胞因子信号转导抑制因子3在早产胎盘中的表达及临床意义。方法选取2013年4~10月解放军第三〇九医院收治的20例早产妇女作为实验组，20例足月妊娠妇女作为对照组，收集两组胎盘组织。应用Western blot法检测两组胎盘组织中SOCS3分子的表达水平，采用免疫组织化学法检测两组细胞因子白细胞介素(IL)10、肿瘤坏死因子(TNF)α的表达水平。比较2种因子在两组胎盘中的差异表达情况。结果与对照组相比，实验组胎盘组织中SOCS3阳性表达量明显增高(1.09±0.29比0.81±0.22，P<0.05)，IL-10阳性表达率明显高于对照组(85.0%比45.0%；P<0.05)，而实验组TNF-α表达阳性率则明显降低(25.0%比70.0%，P<0.05)。结论SOCS3及IL-10在早产胎盘中表达较高，相反TNF-α表达降低，其是可能SOCS3是通过对Th1/Th2的平衡调节，导致了早产的发生重要原因之一。

关键词：早产；细胞因子信号转导抑制因子3；白细胞介素10；肿瘤坏死因子α

早产儿身体功能发育相对不完善，其出生后生存能力低、病死率高，目前有研究显示75%以上的围生儿死亡与早产有关[1]。因此如何早期发现预警早产、干预早产是值得深入研究的课题，研究表明细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)在免疫调控中作用突出，其通过影响细胞因子的相互调节作用导致Th1/Th2平衡改变，从而影响妊娠结局[2-3]。因此，本研究通过分析SOCS3在早产胎盘与足月胎盘中的表达情况，进一步探索SOCS3在早产胎盘中的表达及临床意义。

1资料与方法

1.1一般资料选取2013年4~10月解放军第三〇九医院收治的早产妇女20例作为实验组，20例足月妊娠妇女作为对照组。早产组纳入标准按第6版《妇产科学》标准[4-5]执行，对照组为无产科并发症及内科合并症，以获取两组妇女妊娠后的胎盘组织作为研究材料。其中实验组妇女年龄20～37岁，平均(28.6±3.7)岁；孕周28～35周，平均(32.3±1.4)周。对照组妇女年龄20～38岁，平均(26.8±2.8)岁；孕周37～41周，平均(39.7±0.5)周。

1.2纳入与排除标准①平素月经规律，无甲状腺功能异常及糖尿病等内分泌疾病，无其他慢性全身性疾病，无有害有毒物质及放射线接触史；②夫妇双方染色体G显带核型分析正常；③经妇检、阴道超声等检查排除生殖系统解剖结构异常；④抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗精子抗体检测阴性，优生4项检测阴性；⑤白带化验正常，支原体、衣原体检测阴性，排除生殖道感染。此实验方案已通过本院伦理委员会的审查，两组孕妇均签署知情同意书，同意并支持此次样本的采集。

1.3样本采集两组孕妇在胎盘娩出后10 min内在脐轮正对面(本研究并不涉及胎盘各区域的差异性，选取脐轮正对面只为方便定位同位置，以降低胎盘各区域差异性带来的误差)剪取2 cm×1 cm×1 cm组织，均分两份，0.9%氯化钠溶液漂洗后，一份置于-80 ℃冰箱冻存，一份置于4%甲醛溶液固定。

1.4试剂Western Breeze试剂盒，BCA法蛋白定量试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)，二步法免疫组织化学检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)凝胶制备试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，内参β-actin(北京中杉金桥生物技术有限公司)，WIP组织细胞裂解液(北京博奥森生物技术有限公司)，彩色预染中分子蛋白质分子量标准(武汉博士德生物工程有限公司进口分装)，SOCS3(h-103)(SANTA CRUZ Biotechnology,Inc.)，Bio-Rad电泳仪，电转仪酶标仪，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司)，白细胞介素(interleukin,IL)10 Rabbit Anti、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)Rabbit Anti(武汉博士德生物工程有限公司)，蛋白上样缓冲液(上海新锐生物科技有限公司)。

1.5Western blot检测各组中SOCS3蛋白表达情况取-80 ℃冻存胎盘组织，研磨裂解提蛋白，按照BCA试剂盒操作说明测定蛋白水平，蛋白变性备用。制作聚丙烯酰胺凝胶，按每泳道50 μg蛋白量上样，电泳分离转膜，110 V恒压转膜50 min，封闭液常温封存1 h，加入SOCS3多克隆抗体孵育，置4 ℃冰箱8 h，添加Western Breeze二抗，37 ℃恒温孵育2 h，碱性磷酸酶法显色30 min，β-actin作内参对照，凝胶图像采集系统采集图像，目的蛋白/β-actin灰度值表示蛋白的相对表达水平。

1.6免疫组织化学检测通过免疫组织化学检测IL-10及TNF-α在各组胎盘组织的表达情况：甲醛固定24 h后标本用乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明处理后石蜡包埋。根据免疫组织化学试剂盒(上海泽迈生物技术有限公司)提供的步骤进行。高倍镜下细胞内出现棕黄颗粒为阳性表达，每张切片在高倍镜下选取3个连续不重复的视野，利用Image Pro-plus 6.0图像分析软件进行的定位、定量，采用显色轻度与阳性细胞百分率法相结合判读结果。每例最后得分为染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0分为(-)，1~4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。结果判断在双盲下进行，每张切片由两名高年资病理科医生分别计数[2]。

2结果

2.1SOCS3在胎盘组织的表达情况实验组胎盘组织中SOCS3的阳性细胞表达量为1.09±0.29，对照组表达量为0.81±0.22，实验组胎盘组织SOCS3的阳性表达量明显升高(t=10.21，P<0.05)，见图1。

图1对照组和实验组细胞因子信号转导抑制因子(SOCS3)蛋白表达情况比较对照组：足月妊娠妇女胎盘；实验组：早产妇女胎盘

2.2IL-10、TNF-α在各组胎盘组织的表达情况IL-10在实验组中阳性表达率为85.0(17/20)，显著高于对照组的45.0%(9/20)，差异有统计学意义(χ2=4.286，P<0.05)，实验组IL-10阳性表达强度较对照组高(Z=4.462,P<0.01)；TNF-α在实验组中阳性表达率为25.0%(5/20)，显著低于对照组的70.0%(14/20)，差异有统计学意义 (χ2=8.120，P<0.01)，实验组TNF-α阳性表达强度较对照组低(Z=2.795,P<0.01)。见表1。

表1　两组胎盘组织中IL-10、TNF-α的阳性表达情况比较　(例)

IL-10：白细胞介素10；TNF-α：肿瘤坏死因子α；实验组：早产妇女;对照组:足月妊娠妇女

3讨论

生殖免疫学认为，妊娠是一种成功的同种异体移植现象，正常妊娠的维持有赖于妊娠母体对胚胎半同种抗原的免疫耐受，此种免疫调节不仅发生在母体的全身免疫系统，而且也发生在妊娠子宫的局部，局部免疫更直接影响着胚胎的着床、发育，在维持正常人身中起重要作用，这种耐受一旦被破坏，则导致病理妊娠，如流产、早产等[3-4]。辅助性T淋巴细胞分为Th1和Th2亚群，Th1型细胞分泌TNF-α、IL-2、干扰素γ，介导细胞免疫应答；Th2型细胞分泌IL-10、IL-4、IL-6等，介导体液免疫应答。研究发现，在母胎界面SOCS3主要表达在Th2型细胞中并抑制Th1型细胞因子的分泌，抑制Th1型细胞因子的免疫反应，维持Th2占优势的Th1/Th2平衡[4-5]。这种平衡是保持母体对胚胎免疫耐受的关键因素，决定着妊娠的结局[6-7]。IL-10作为Th2型细胞因子是重要的抗炎性因子，妊娠时IL-10可直接抑制母胎界面的自然杀伤细胞，抑制TNF-α、IL-2等Th1型细胞因子反应，并且通过抑制一氧化氮生成来抑制巨噬细胞，相应减少胎儿、胎盘的血液循环，从而间接抑制母体对胚胎的免疫排斥[8-9]。

本实验研究了SOCS3、IL-10、TNF-α在早产胎盘及正常妊娠胎盘组织中的表达情况，结果显示，实验组SOCS3表达量显著高于对照组，IL-10阳性表达强度较对照组高，而TNF-α阳性表达强度较对照组低，说明3种因子的差异表达与早产确实存在关联性。IL-10在两组胎盘组织中均有表达，但实验组显著高于对照组，也支持SOCS3高于正常的实验结果，说明胎盘界面SOCS3的高表达，从而导致IL-10过表达，以此打破了母胎界面Th1/Th2平衡，从而导致早产的发生。TNF-α作为Th1型细胞因子，是重要的炎症和免疫调节因子。生理情况下，适量的TNF-α可调节滋养层细胞的正常增殖、分化和凋亡，促进胚胎发育，对妊娠的维持具有重要作用。TNF-α的分泌受Th2型细胞因子IL-10、IL-4等抑制，本研究结果显示，实验组TNF-α阳性率低于正常组，支持早产患者胎盘SOCS3表达高于正常以及IL-10高于正常的实验结果。

SOCS3作为细胞因子信号转导抑制因子SOCS家族中的重要成员，是现阶段此家族成员中研究最为广泛和深入的一种。SOCS3可表达于多种细胞中，目前研究证实其主要通过以下3种途径影响细胞因子的信号转导：①通过抑制JAK激酶活性阻断JAK-STAT通路[9]；②与细胞因子受体结合，阻断STAT活性；③通过增加蛋白酶体的活性，加速JAK-STAT途径信号蛋白的水解[10-12]；SOCS3通过以上机制影响IL、TNF、干扰素等多种细胞因子的信号转导，并在T细胞的分化和免疫调控中扮演重要角色，是机体固有免疫和获得性免疫的重要调节因子。但在本研究中对不同T细胞因子的表达情况进行分析，证明Th1/Th2平衡破坏在早产中的重要作用，进一步丰富了生殖免疫理论，同时通过此研究结合既往SOCS3相关信号通路研究结果，可以大胆推测其相关的信号转导途径，为将来进一步深入研究早产机制奠定了新的理论基础,为预警及预防早产提供了实验室参考。

综上所述，SOCS3参与早产的发生，其影响机制可能是影响细胞因子，调剂T细胞平衡，通过IL-10高表达，同时多于生理量的SOCS3、IL-10抑制TNF-α的表达，导致TNF-α水平过低，破坏母胎界面Th1/Th2免疫平衡状态，导致早产的发生。研究表明，SOCS3在导致早产发生的过程中作用越来越明显[13]，但是仍有许多机制尚未不清楚，需要进一步研究证实。

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Expression of SOCS3 and Its Significance in Preterm PlacentaWENNa,ZHANGQiao-yu,WANGZhen-guo.(DepartmentofGynecologyandObstetrics,PLA309thHospital,Beijing100091,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of suppressor of cytokine signaling (SOCS3) and its significance in preterm placenta.MethodsRetrospective analysis was made on 20 patients(observation group) who had spontaneous preterm labor and 20 pregnant women(control group) with normal delivery during the same period,the patients were from PLA 309th Hospital during Apr. 2013 and Oct. 2013.The expression of SOCS3 in placenta were examined by Western blot,the expression of interleukin (IL)-10 and tumor mecrosis factor α (TNF-α) was detected by immunohistochemical method.The differences of expression of SOCS3,IL-10,TNF-α were compared.ResultsCompared with normal delivery，the expression of SOCS3 and IL-10 were significantly increased in placenta with preterm birth(SOCS3:1.09±0.29 vs 0.81±0.22, P<0.05; IL-10:85.0% vs 45.0%,P<0.05),and expression of TNF-α was significantly decreased in placenta with preterm birth(25.0% vs 70.0%,P<0.05).ConclusionThe expression of SOCS3 and IL-10 were increased and TNF-α was decreased in placenta with preterm birth,and SOCS3 may influence the Th1/Th2 balance and is one of the important causes leading to preterm birth.

Key words:Preterm birth; Suppressors of cytokine signaling 3; Interleukin-10； Tumor necrosis factor α

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-02-27编辑：相丹峰

基金项目：解放军第三〇九医院课题(2013MS-012)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.048

中图分类号：R714.7

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)18-3394-03