人参皂苷Rg3诱导乳腺癌MCF7Adr细胞凋亡的作用及其可能的分子机制

张　立

(武汉大学人民医院药品试剂供应科，武汉 430060)



人参皂苷Rg3诱导乳腺癌MCF7Adr细胞凋亡的作用及其可能的分子机制

张立

(武汉大学人民医院药品试剂供应科，武汉 430060)

摘要：目的研究人参皂苷Rg3诱导乳腺癌MCF7Adr细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。方法培养乳腺癌MCF7Adr细胞，分为不含胎牛血清和药物培养基处理的对照组以及100、200、400、800 μmol/L人参皂苷Rg3处理的处理组。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况，Western-blot方法检测细胞周期蛋白E(Cyclin E)、细胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)水平。结果100 μmol/L人参皂苷组、200 μmol/L人参皂苷组、400 μmol/L人参皂苷组、800 μmol/L人参皂苷组的MTT值、Cyclin E、CDC25A蛋白水平均低于对照组[(76.4±16.4)、(56.3±11.5)、(35.2±6.9)、(20.4±4.2)比(100.0±19.5)；(84.3±16.1)、(60.5±12.1)、(39.1±5.2)、(24.5±3.9)比(100.0±18.5)；(79.5±14.8)、(59.1±10.9)、(35.4±6.1)、(22.7±4.2)比(100.0±18.5)]，差异均有统计学意义(均P<0.01)。；MTT值与Cyclin E、CDC25A蛋白水平呈正相关(P<0.05)。结论人参皂苷Rg3能剂量依赖性地诱导乳腺癌MCF7Adr细胞凋亡，且这一作用是通过抑制Cyclin E、CDC25A的表达来发挥的。

关键词：乳腺癌；人参皂苷Rg3；凋亡；细胞周期蛋白E

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，在临床治疗时多采用手术切除、化疗、生物治疗等综合疗法。常规的化疗药物具有较强的不良反应，且容易产生抗药性，整体的化疗效果并不理想。近年来，临床学者致力于探究具有抗肿瘤作用的天然化合物，从人参根中提取的人参皂苷单体是具有抗肿瘤作用的纯天然化合物。本研究主要分析人参皂苷Rg3诱导乳腺癌MCF7Adr细胞凋亡的作用，并对其可能的分子机制进行探究。

1材料与方法

1.1材料乳腺癌细胞系MCF7Adr购买于中国科学院细胞库；杜尔伯科极限必需培养基(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)培养基和胎牛血清均购买于美国Sigma公司；抗体购买于英国Abcam公司；离心管和细胞培养板购买于美国Corning 公司；人参皂苷Rg3由医院药剂科提供。

1.2方法

1.2.1细胞培养方法冻存在液氮罐中的细胞取出后复苏，在15 cm2的培养瓶中培养，待细胞处于对数生长期且铺满培养瓶底面70%～80%时进行传代，分别接种于培养瓶和培养板中。培养瓶中的细胞用于继续传代，培养板中的细胞用于加药处理。

1.2.2细胞处理方法当培养板中的细胞铺满50%～60%时，用不含胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培养基处理细胞24 h，使其生长同步化，随后分别用不含FBS和药物培养基处理(对照组)，100、200、400、800 μmol/L 人参皂苷Rg3处理(处理组)。24 h后收集细胞进行噻唑蓝(MTT)检测和Western-blot检测。

1.2.3MTT法药物处理24 h后，小心吸去上清，加入160 μL DMEM培养基、40 μL 0.5% MTT溶液，孵箱中继续培养4 h。随后吸尽上清，每孔加入200 μL二甲基亚砜，置于摇床上低速振荡10 min，而后在酶标测仪上检测490 nm处的吸光值，以对照组的吸光值为100，计算观察组吸光值的相对值。

1.2.4Western-blot检测配置RIPA蛋白裂解液，每个细胞孔中加入60 μL，用细胞刮刀充分刮碎细胞并吸出裂解液，离心后去上清进行检测。检测时，首先按照配方配置4%的浓缩胶和10%的分离胶，将蛋白样品加入点样孔中并进行电泳，垂直电泳方法为100 V、20 min，120 V、90 min，完成后进行电转膜，方法为100 V、90 min。转膜后取出硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中封闭2 h，而后在1∶1000的细胞周期蛋白E(Cyclin E)、细胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A，CDC25A)、actin第一抗体中孵育过夜。第2日，将硝酸纤维素膜置于TBST溶液中洗涤3遍，而后用辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行孵育，1 h后再次用TBST洗涤3遍，最后进行显影。计算蛋白条带的灰度值，以目的基因的灰度值/内参actin灰度值作为蛋白含量，令空白对照组的蛋白含量作为100，计算处理组目的基因的蛋白含量。

2结果

2.1各组MTT检测结果及Cyclin E、CDC25A表达量比较对照组、100 μmol/L人参皂苷组、200 μmol/L人参皂苷组、400 μmol/L人参皂苷组、800 μmol/L人参皂苷组各组间MTT值比较差异有统计学意义(P<0.05)； 100 μmol/L人参皂苷组、200 μmol/L人参皂苷组、400 μmol/L人参皂苷组、800 μmol/L 人参皂苷组的MTT值均低于对照组，差异有统计学意义(t=6.886，t=9.966，t=16.623，t=26.223，均P<0.01)。对照组、100 μmol/L人参皂苷组、200 μmol/L人参皂苷组、400 μmol/L人参皂苷组、800 μmol/L人参皂苷组各组间Cyclin E、CDC25A蛋白水平比较差异有统计学意义(均P<0.05)，100 μmol/L人参皂苷组、200 μmol/L人参皂苷组、400 μmol/L人参皂苷组、800 μmol/L人参皂苷组的Cyclin E、CDC25A蛋白水平均低于对照组，差异有统计学意义(t=4.985，t=7.113，t=16.623，t=22.334，均P<0.01；t=5.342，t=8.823，t=17.103，t=24.423，均P<0.01)，见表1。不同浓度人参皂苷Rg3处理后细胞Cyclin E、CDC25A表达量的电泳结果见图1。

表1各组MTT检测结果及Cyclin E、CDC25A

表达量比较

组 别MTT值CyclinE蛋白CDC25A蛋白对照组100.0±19.5100.0±18.5100.0±18.5100μmol/L人参皂苷组76.4±16.4a84.3±16.1a79.5±14.8a200μmol/L人参皂苷组56.3±11.5a60.5±12.1a59.1±10.9a400μmol/L人参皂苷组35.2±6.9a39.1±5.2a35.4±6.1a800μmol/L人参皂苷组20.4±4.2a24.5±3.9a22.7±4.2aF17.79215.34517.7293P<0.05<0.05<0.05

MTT：噻唑蓝；Cyclin E：细胞周期蛋白E；CDC25A：细胞分裂周期蛋白25A；a与对照组比较，P<0.01

图1　不同浓度人参皂苷Rg3处理后细胞周期蛋白E(Cyclin E)、细胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)表达量的检测结果　a与对照组比较，P<0.05

2.2细胞增殖能力与Cyclin E、CDC25A蛋白含量的线性回归分析以MTT值为自变量，Cyclin E、CDC25A蛋白含量为应变量进行线性回归分析可知，MTT值与Cyclin E、CDC25A蛋白含量呈正相关(P<0.05),见表2。

表2　细胞增殖能力与Cyclin E、CDC25A

Cyclin E:细胞周期蛋白E；CDC25A：细胞分裂周期蛋白25A

3讨论

近年来，人参皂苷单体的抗肿瘤作用受到了越来越多的关注，Zhang等[1]的在体研究结果显示，腹腔注射人参皂苷可以抑制小鼠体内卵巢癌的生长、减小瘤体体积。人参皂苷的活性单体形式包括人参皂苷Rg3、Rh2等，活性单体均能作用于不同的靶点来发挥抗肿瘤作用[2]。人参皂苷Rg3是一种从人参根的浸出液中分离出的四环三萜皂苷[3]。陈云等[2]在乳腺癌MCF-7细胞系中的研究发现，人参皂苷Rg3能使G0/G1期、S期细胞的数目显著减少，而G2/M期细胞的数目显著增多，细胞增殖停滞；同时，人参皂苷Rg3还能有效抑制MCF-7细胞株的增殖和侵袭能力。本研究通过MTT方法检测乳腺癌MCF7Adr细胞株的细胞活力可知，人参皂苷Rg3处理组的MTT值低于对照组，且效应具有剂量依赖性。这一结果也与Ge 等[4]在体内实验和离体实验的结果一致，可以反映出人参皂苷Rg3在抑制乳腺癌细胞增殖中的确切价值。

无限的增殖能力以及向周围组织极强的迁移、侵袭能力是恶性肿瘤细胞最具特征性的生物学行为，这也是导致化疗药物耐受、肿瘤局部复发以及远处转移的决定性因素[5]。恶性肿瘤细胞的增殖过程受多种机制的调控，其中CDC25A、Cyclin E是两种在细胞增殖过程中发挥重要作用的蛋白[6]。CDC25A是双重特异性磷酸酶家族的成员之一，作用靶点为细胞周期蛋白依赖性激酶，通过催化细胞周期蛋白依赖性激酶发生去磷酸化并促进细胞增殖由G1期进入S期[7]。目前，在结肠癌、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的研究中均发现CDC25A呈高表达状态，且与患者的预后情况密切相关[8-9]。Cyclin E是一类细胞周期蛋白，在细胞增殖的G1～S期表达，通过与细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)结合并形成Cyclin E-CDK2复合物，CDK2激活后可调节细胞由G1期向S期过渡。在恶性肿瘤细胞中，Cyclin E过度表达可使CDK2持续激活，并促进肿瘤细胞的不断增殖[10]。Gao等[11]研究发现，乳腺癌细胞中存在Cyclin E和CDK2的异常表达，表现为Cyclin E的表达与细胞周期不同步。

目前，虽然人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用已受到广泛认可，但关于该药物具体的分子机制尚未完全阐明，药物潜在的分子作用靶点仍处于未知状态。探寻在乳腺癌癌细胞无限增殖过程中的关键分子，有助于为寻找更为有效的生物治疗靶点。如前所述，CDC25A、Cyclin E是两种与细胞增殖和细胞周期密切相关的蛋白[12]，通过Western blot的方法检测乳腺癌细胞中相关蛋白的含量可知，人参皂苷Rg3处理组的CDC25A、Cyclin E蛋白含量均低于对照组，且效应具有剂量依赖性。这就初步反映了人参皂苷Rg3对CDC25A、Cyclin E的调控作用，也可能是人参皂苷Rg3抑制细胞增殖的潜在分子机制。在此基础上，本研究进行线性回归分析结果显示，MTT值与Cyclin E、CDC25A蛋白含量呈正相关，提示下调CDC25A、Cyclin E可能是人参皂苷抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制。

综上所述，人参皂苷Rg3能剂量依赖性地诱导乳腺癌MCF7Adr细胞凋亡，且这一作用是通过抑制Cyclin E、CDC25A的表达来发挥的。

参考文献

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[2]陈云，张竝，俞勇，等.人参皂苷Rg3对乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭的影响[J].中国现代应用药学，2013，30(7)：722-725.

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Effect of Ginsenoside Rg3 on the Induction of MCF7Adr Cells Apoptosis of Breast Cancer and Its Possible Molecular MechanismsZHANGLi.(DepartmentofReagentsandSupply,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of Ginsenoside Rg3 on the induction of MCF7Adr cells apoptosis of breast cancer and its possible molecular mechanisms.MethodsMCF7Adr breast cancer cells were cultured and divided into control group treated with DMEM without FBS and drug,treatment group treated with 100,200,400, 800 μmol/L of ginsenoside Rg3.Cell proliferation was detected by MTT method, protein levels of Cyclin E,cell division cycle (CDC)25A were detected by Western-blot method.ResultsMTT value and protein level of Cyclin E,CDC25A of 100 μmol/L ginsenoside group，200 μmol/L ginsenoside group，400 μmol/L ginsenoside group，800 μmol/L ginsenoside group were lower than those in control group[(76.4±16.4),(56.3±11.5),(35.2±6.9),(20.4±4.2) vs (100.0±19.5)；(84.3±16.1),(60.5±12.1),(39.1±5.2),(24.5±3.9) vs (100.0±18.5)；(79.5±14.8),(59.1±10.9),(35.4±6.1),(22.7±4.2)vs(100.0±18.5)](P<0.01);MTT value was positively correlated content of protein Cyclin E,CDC25A(P<0.05).ConclusionGinsenoside Rg3 can dose dependently induce MCF7Adr cells apoptosis of breast cancer and which is functioned through inhibiting the expression of Cyclin E,CDC25A.

Key words:Breat cancer; Ginsenoside Rg3; Apoptosis; Cyclin E

收稿日期：2014-09-29修回日期：2015-02-27编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.047

中图分类号：R737.9

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)18-3391-03