头顶一颗珠对肝癌小鼠免疫功能影响的实验研究

宋秀三，李玉山，詹光杰

(1.恩施自治州中心医院肿瘤科，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000)



头顶一颗珠对肝癌小鼠免疫功能影响的实验研究

宋秀三1，李玉山2※，詹光杰2

(1.恩施自治州中心医院肿瘤科，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000)

摘要：目的研究头顶一颗珠(TTM)注射液对肝癌模型小鼠免疫功能的影响。方法建立H22小鼠肝癌模型，将造模成功的肝癌小鼠依据随机数字表法分为模型组、氟尿嘧啶(5-FU)组、5-FU+TTM组和TTM组，每组10只。模型组、5-FU组每日按10 mg/kg腹腔注射生理盐水及5-FU，5-FU+TTM组在注射5-FU的同时每日腹腔按7.2 g/kg注射TTM，TTM组按7.2 g/kg注射TTM。给药5 d后测定各组胸腺、脾脏指数，检测外周血中白细胞、淋巴细胞及CD3、CD4、CD8细胞的百分比，血清中白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果5-FU组和TTM组的胸腺指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而5-FU+TTM组显著高于模型组(P<0.05)。与模型组比较，5-FU 组外周血白细胞与淋巴细胞数量明显减少(P<0.05)，TTM组显著增加(P<0.05)；5-FU+TTM组白细胞数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与5-FU组比较，TTM组白细胞与淋巴细胞数量显著增加(P<0.05),5-FU+TTM组白细胞数量明显增多(P<0.05)，但淋巴细胞数量变化差异无统计学意义(P>0.05)。相对于模型组，TTM组、5-FU+TTM组及5-FU组CD3、CD4百分比显著增加(P<0.05)，CD8百分比变化差异无统计学意义(P>0.05)；与较 5-FU+TTM组比较，TTM组、5-FU组CD3、CD4百分比差异无统计学意义，但CD8百分比显著增加(P<0.05)。相对于模型组，TTM组、5-FU+TTM组及5-FU组IL-2、TNF-α水平显著增加(P<0.05)；与TTM组比较，5-FU+TTM组、5-FU组IL-2水平差异无统计学意义(P>0.05)，但5-FU组TNF-α水平显著增加(P<0.05)，5-FU+TTM组差异则无统计学意义(P>0.05)。结论TTM可以促进T细胞的成熟与迁移，提高肝癌小鼠IL-2、TNF-α水平，增强机体免疫力，具有抗肿瘤功能。

关键词：头顶一颗珠；H22肝癌小鼠；免疫

头顶一颗珠(Trillium tschonoskii Maxim，TTM)是土家族、苗族地区应用较多的一种珍稀药材，常被当地人奉为“神药”,是百合科延龄草属植物延龄草的干燥根茎与成熟的果实[1]。其含有甾体皂苷、黄酮苷及倍半萜苷等活性成分，研究表明，TTM具有抗炎镇痛、改善心肺功能，提高免疫力、降压、抗衰老等功效[2-4]。由于繁殖相对比较困难，野生资源稀少，TTM的研究与开发受到一定限制。为充分保护、开发利用这一宝贵资源，人们从不同方面对TTM进行研究。本研究对小鼠H22肝癌细胞移植瘤模型注射TTM，观察TTM对肝癌小鼠免疫功能的影响，探讨TTM抗肿瘤的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物无特定病原体级昆明种雄性小鼠40只，5周龄，体质量为16.2～23.7 g，平均(20.3±1.4) g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，常规饲养，生产许可证号： SCXK(鄂)2008-0005。

1.2实验药品与仪器小鼠H22细胞(上海博谷生物科技有限公司)，氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)(上海旭东海普药业有限公司，批号：H31020593)，CD3、CD4、CD8荧光抗体(美国Beckman公司)，红细胞裂解液及溶血素(美国Beckman公司)，白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)检测试剂盒(南京建成生物制品研究所)，其他化学试剂为国产分析纯试剂(湖北恩施乐之塬科技公司)。精密电子天平(上海天平仪器厂)，全自动酶标仪(美国Thermo公司)，低温冷冻离心机(美国Beckman公司)、流式细胞仪(美国Beckman公司)。

1.3TTM注射液TTM由湖北省恩施市板桥乡中药材生产基地提供，采用水提醇沉法制成含生药30%(相当于生药含量2 g/mL)的液体,用时以0.9%氯化钠注射液稀释成 0.4 g/mL，瓶装密封消毒贮存于4 ℃备用[4]。

1.4动物造模、分组及给药瘤源动物为H22传代7 d的腹水小鼠，选择状态好、腹水多的小鼠抽取3 mL腹水，显微镜下血细胞计数细胞数约为2.0×108/mL。取1 mL腹水用灭菌0.9%氯化钠注射液配成细胞悬液，镜下细胞计数，调整细胞浓度为2.0×107/mL作为接种用瘤液。精确称量40只无特定病原体级雄性昆明种小鼠，75%乙醇对左腋下消毒，皮下注射接种用瘤液0.2 mL[5-6]，制成肝癌模型小鼠。将造模后小鼠依据随机数字表法分为模型组、TTM组、5-FU+TTM组及5-FU组，每组10只。模型组、5-FU组每日按10 mg/kg腹腔注射0.9%氯化钠注射液及5-FU，5-FU+TTM组在注射5-FU的同时每日腹腔按7.2 g/kg注射TTM，TTM组按7.2 g/kg注射TTM。各组自由饮食，连续饲养5 d[6]。

1.5胸腺、脾脏指数测定给药5 d后再精确称量各组小鼠，75%乙醇消毒，眼球取血后断颈处死，小心取出胸腺、脾脏，放入冰冻0.9%氯化钠注射液冲洗拭干，迅速用精密分析天平称取重量，测定胸腺、脾脏指数[胸腺、脾脏重量(mg)/体质量(g)×10]。

1.6外周血淋巴细胞检测在falcon进样管中加入20 μL荧光抗体，然后加入100 μL抗凝血，低速离心室温静置15 min，再加入稀释的溶血素450 μL，稍稍低速离心后静置10 min后利用流式细胞仪对淋巴细胞进行分析[6]。

1.7血清IL-2、TNF-α检测小心收集小鼠血液于无内毒素、热原的促凝管中，4 ℃，10 000 r/min离心15 min，于 -70 ℃ 保存备用。血清中IL-2、TNF-α水平检测参考试剂盒说明书采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法。

2结果

2.1TTM对肝癌小鼠胸腺、脾脏指数的影响5-FU组和TTM组的胸腺指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而5-FU+TTM组显著高于模型组(P<0.05)，5-FU组胸腺指数与TTM组差异无统计学意义(P>0.05)，但5-FU+TTM组则显著增加(P<0.05)，见图1；各组脾脏指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1头顶一颗珠(TTM)对肝癌小鼠胸腺指数的影响5-FU：5-氟尿嘧啶;a与模型组比较，P<0.05；b与TTM组比较，P<0.05

2.2TTM对肝癌小鼠外周血白细胞、淋巴细胞的影响与模型组比较，5-FU组的白细胞与淋巴细胞数量明显减少(P<0.05)，TTM组两种细胞数量显著增加(P<0.05)；5-FU+TTM组白细胞数与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)，而淋巴细胞数量明显减少(P<0.05)；与5-FU组比较，TTM组白细胞与淋巴细胞数量显著增加(P<0.05),5-FU+TTM 组白细胞数量明显增多(P<0.05)，但淋巴细胞数量变化差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2头顶一颗珠(TTM)对肝癌小鼠外周血白细胞、淋巴细胞的影响5-FU：5-氟尿嘧啶;a与模型组比较，P<0.05；b与5-FU组比较，P<0.05

2.3TTM对肝癌小鼠外周血CD3、CD4及CD8的影响与模型组比较，TTM组、5-FU+TTM组及5-FU组CD3、CD4百分比均有显著增加(P<0.05)，CD8百分比变化差异无统计学意义(P>0.05)；与5-FU+TTM组比较，TTM组、5-FU组CD3、CD4百分比差异无统计学意义(P>0.05)，但CD8百分比显著增加(P<0.05)。见图3。

图3头顶一颗珠(TTM)对肝癌小鼠外周血CD3、CD4及CD8的影响5-FU：5-氟尿嘧啶;a与模型组比较，P<0.05；b与5-FU+TTM组比较，P<0.05

2.4TTM对肝癌小鼠血清中IL-2、TNF-α水平的影响与模型组相比，TTM组、5-FU+TTM组及5-FU组IL-2、TNF-α水平均显著增加(P<0.05)；与TTM组比较，5-FU+TTM组、5-FU 组IL-2水平差异无统计学意义(P>0.05)，但5-FU组TNF-α水平显著增加(P<0.05)，5-FU+TTM组虽有增加但差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4　头顶一颗珠(TTM)对肝癌小鼠血清中　IL-2、TNF-α水平的影响　　IL-2：白细胞介素2；TNF-α：肿瘤坏死因子α；5-FU：5-氟尿嘧啶； a与模型组比较，P<0.05； b与TTM组比较，P<0.05

3讨论

在抗肿瘤的临床实践中，大多数抗肿瘤化学药物由于缺少选择作用，患者接受放疗、化疗时虽然杀死了肿瘤细胞，但正常机体也受到不同程度的损伤。在肿瘤患者治疗中，中医药不仅可以减轻不良反应，治疗效果也有明显提升，中医药对肿瘤及其术后、放化疗中的综合治疗具有重要的临床意义和良好的疗效，加强中药在抗肿瘤机制方面的研究，开发和利用新型抗肿瘤中药具有重要意义[7-8]。

胸腺、脾脏是两个重要的免疫器官，在抗肿瘤药物的作用下会导致一定质量的变化，因此该器官质量的变化可以作为观察药物对免疫影响的指标[9]。在本研究中，观察肝癌小鼠注射TTM后对胸腺、脾脏质量的影响，结果表明其对脾脏质量及指数无明显影响，但5-FU与TTM混合使用后可以显著提高胸腺质量和指数，胸腺能促使T细胞的分化与发育，提示TTM可以促进T细胞的成熟与迁移。

目前认为细胞免疫是机体抗肿瘤的主要免疫机制，体液免疫协同，其中T细胞介导的特异性免疫应答起至关重要的作用。张立春等[10]研究认为，参麦注射液配合化疗治疗肿瘤可以预防白细胞减少，以减轻化疗的不良反应，同时使淋巴细胞数量增加，增强机体的免疫功能。本研究结果表明，注射TTM的肝癌小鼠白细胞及CD3、CD4、CD8数量有明显增加，提示TTM可有效促进T淋巴细胞水平，调节机体内免疫功能，表明中药TTM对化疗患者免疫细胞有一定的保护作用。

IL-2能激活、调节免疫细胞，参与体液免疫，通过促进T细胞的增殖与分化而发挥免疫作用，TNF-α在机体内正常情况

下水平较低，通过激活核因子κB或c-Jun氨基末端激酶信号转导通路调控肝细胞[11]，具有抑制肿瘤增殖的作用，是目前发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子[5]。本研究结果表明，TTM能提高肝癌小鼠IL-2、TNF-α水平，提示TTM可增强机体免疫力，具有抗肿瘤功能。

本研究结果表明，TTM与5-FU联用可有效提高机体免疫力，通过提高IL-2、TNF-α水平，改善脾脏微环境从而影响T细胞亚群来减轻5-FU对机体的不良影响，从而提高机体自身抗肿瘤能力，因此，TTM可作为辅助化疗药物，提高肿瘤治愈率。

参考文献

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临床研究

The Experimental Study on the Effect of Trillium tschonoskii Maxim on Immune Functions of Hepatoma-MiceSONGXiu-san1，LIYu-shan2，ZHANGGuang-jie2.(1.DepartmentofOncology,CenterHospitalofEnshiStateofHubeiProvine,Enshi445000,China；2.MedicalSchoolofHubeiMinzuUniversity,Enshi445000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of Trillium tschonoskii Maxim(TTM) injection on immune functions of mice modeled with hepatoma.MethodsH22 hepatoma-mice model was built,and the hepa-toma-mice with successful modeling were randomly divided into model group,5-FU group,5-FU+TTM group and TTM group,10 mice in each group.The model group mice and the 5-FU group mice were given physiological saline intraperitoneal injection with 10 mg/kg per day.The 5-FU+TTM group mice were given TTM intraperitoneal injection with 7.2 g/kg at the same time,and the TTM group mice were injected with 7.2 g/kg.The index of thymus and spleen,the proportion of leucocyte,lymphocyte and CD3,CD4,CD8cells in the periphearl blood,and the concentration of IL-2,TNF-α in serum after five days′ medicines were measured.ResultsThe thymus index of mice in 5-FU group and TTM group had no statistical significance and 5-FU+TTM group increased obviously compared with the model group(P<0.05);the amount of leucocyte and lymphocyte of peripheral blood in 5-FU group decreased obviously(P<0.05)and the TTM group increased obviously(P<0.05)compared with the model group;the amount of leucocyte in 5-FU+TTM group had no statistical significance compared with the model group;the amount of leucocyte and lymphocyte in TTM group increased obviously compared with 5-FU group(P<0.05); the amount of leucocyte increased obviously in 5-FU+TTM group,but the amount of lymphocyte had no statistical significance.The proportion of CD3,CD4in TTM group,5-FU+TTM group and 5-FU group increased significantly(P<0.05) and the proportion of CD8had no statistical significance compared with the model group(P>0.05).The proportion of CD3,CD4in TTM group,5-FU group had no statistical significance,but the proportion of CD8increased obviously compared with 5-FU+TTM group(P<0.05).The contents of IL-2,TNF-αin TTM group,5-FU+TTM group and 5-FU group increased obviously compared with the model group(P<0.05); compared with TTM group,the contents of IL-2 had no obvious difference and had no statistical significance (P>0.05) in 5-FU+TTM group and 5-FU group,but contents of TNF-α in 5-FU group increased obviously(P<0.05) and the contents in 5-FU+TTM group had no statistical significance(P>0.05).ConclusionTTM can advance the maturation and metastasis of T cells,improve the level of IL-2,TNF-α of mice with hepatoma,strengthen the organic immunity,thus has the effect of anti-tumor.

Key words：Trillium tschonoskii Maxim; H22 hepatoma-mice; Immunity

收稿日期：2014-10-20修回日期：2015-03-05编辑:伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.051

中图分类号：R285.5 1.中英文摘要(限200左右汉字)、关键词(3～5个)、题目、单位名称及作者署名；1～3个。

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)19-3597-03