PCR 检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因

顾 琳 ，黄 平，宋衍燕，高 艳，邵希凤，韩晓瑄，韩庆华，王军波

(1北京大学医学部公共卫生学院，北京 100191;2北京市朝阳区疾病预防控制中心，北京 100021)

金黄色葡萄菌隶属于葡萄球菌属，是人类重要的致病菌之一。食品中的金黄色葡萄球菌可能引起食物中毒，其致病因素主要为金黄色葡萄球菌肠毒素。金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，目前已发现18 种肠毒素基因型。肠毒素可耐受100℃煮沸30min 而不被破坏。金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，产生的肠毒素对肠道破坏性大，所以金黄色葡萄球菌肠炎起病急、中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻，还会增加慢性病的患病风险，1%—5%的急性胃肠炎患者会转变成严重的疾病或慢性病，如风湿病、僵硬性脊椎炎、Reiter's 综合征、营养吸收不良、溶血性尿毒症、动脉硬化症和格林巴利综合症、肝炎等疾病［1］。2013 年国家卫计委通报的《2013 年全国食物中毒事件情况》显示，微生物性食物中毒事件中毒人数最多，占总中毒人数的60.4%，其中主要是由金黄色葡萄球菌及其肠毒素引起的食物中毒。因此及时检测出食品中的金黄色葡萄球菌及其肠毒素，能够保障食品安全，维护公众健康。本研究通过PCR 技术检测食品中检出的金黄色葡萄球菌肠毒素基因的携带情况，探讨与食物中毒发生相关的金黄色葡萄球菌肠毒素基因类型。

1 材料与方法

1.1 材料

实验室保存菌株，至2012 年共收集食品中检出的金黄色葡萄球菌22 株，其中食物中毒中检出17 株、食品中检出5 株。

1.2 方法

对食品中检出的金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌菌株分离培养，经法国生物梅里埃公司的GP 系统鉴定为金黄色葡萄球菌，再应用PCR 检测每例样本中sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sej、sep、seq、she、sek、sel、ser 等18 种肠毒素基因的携带情况。

1.3 仪器设备及试剂

全自动细菌鉴定系统VitekⅡcompact (法国)、天根细菌DNA 提取试剂盒、伯乐PCR 扩增仪S1000 (美国)、毛细管电泳仪QLAxcel、PCR 试剂:购于达安基因公司。

1.4 引物设计与合成

根据Gen Bank 公布的金黄色葡萄球菌18 种肠毒素的基因序列，利用Primer Premier 5.0 软件及参考文献［2］，引物由invitrogen 中国公司合成，引物序列见表1。

1.5 DNA 的提取

将纯培养的菌株用葡萄球菌溶菌酶裂解细胞壁，用天根细菌DNA 提取试剂盒进行细菌DNA 的提取。提取物作为PCR 扩增的模板。

1.6 PCR 扩增体系及反应条件

扩增反应体系:缓冲液5μL、Taq 酶0.25μL、dNTP3μL、引物1μL、模板1μL，再加灭菌去离子水至25μL。

表1 金黄色葡萄球菌肠毒素基因引物序列

1.7 毛细管凝胶电泳

将PCR 扩增产物按顺序放入QIAxcel 全自动毛细管电泳仪96 孔样品托盘内，在仪器相应位置加入卡夹QIAxcel Gel Cartridge、电泳缓冲液和洗涤液(所有试剂平衡至室温后使用)。锁定卡夹，运行程序。实验结果用软件BioCalculator 进行数据分析。

1.8 统计学处理

应用费歇尔精确卡方检验对实验数据进行统计学分析，认为P ＜0.05 时，差异有统计学意义。

2 结果与分析

22 株金黄色葡萄球菌菌株中检出19 株携带肠毒素基因的菌株，其中携带sea 基因的菌株17 株，检出率77.27%;同时携带seb、seg、sei、sem、sen 基因的菌株1 株;同时携带seg、sei、sem、sen 的菌株1 株。18种肠毒素基因检测均为阴性的菌株3 株，占13.64%。食物中毒和食品两组样品中肠毒素检出的阳性率分别为88.23%和80.00%，经费歇尔精确卡方检验对实验数据进行统计学分析，计算累计概率P=1.835 2，在α=0.05 水平上，认为食物中毒和食品两组携带肠毒素基因的概率不存在统计学差异(表2)。

表2 两组样品中检出的金黄色葡萄球菌肠毒素阳性率比较

3 讨论

20 世纪80 年代有研究表明，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒中，携带sea、seb、sec、sed、see 基因的金黄色葡萄球菌占95%，另外5%由携带其它肠毒素基因的金黄色葡萄球菌引起［3］。然而随着检测技术的发展，样本来源、基因表达、毒力强度变化等影响，新发现的肠毒素基因引起的食物中毒应引起重视。为了解新发现的肠毒素基因在食物中毒中的作用，不仅要对不同来源菌株的各型肠毒素基因分布进行系统和深入的研究，而且要研究各型肠毒素基因间的关系、表达情况、毒素性质。

从试验结果可以看出，携带sea 肠毒素基因的样本占总样本量的77.27%，说明在食品中sea 基因的分布更为集中，这与其它研究中各类食品的金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型检测结果相似［4］。食品样本中检出的金黄色葡萄球菌菌株的肠毒素基因携带率较高，并且存在多重携带的情况。本试验的22 株金葡菌中2 例携带1 种以上肠毒素基因，占9.09%。Janaud 等［5］针对seg、sei 的研究证实，这两种肠毒素均属于金葡菌内一个名叫肠毒素基因群(Enterotoxin gene cluster，egc)的操纵子，该操纵子位于金黄色葡萄球菌基因岛vSAβ 上。Becker等［6］研究表明，egc 与菌株的遗传背景关系密切，而与菌株的地域来源及分布无关，因此二者之间可能存在着协同作用。赵健等［7］用VIDAS 全自动免疫分析仪测定从医院食物中毒患者呕吐物及相关食品标本中分离培养出的金黄色葡萄球菌肠毒素，阳性检出率为56.20%，低于本试验中的结果，提示金黄色葡萄球菌肠毒素基因的携带与肠毒素蛋白的产生，存在多种因素的影响。基因在翻译、表达为蛋白质的过程中会受到机体内环境，以及外界多种因素的影响，因此，尽管检测出肠毒素基因的存在，但在食品样本复杂的环境因素影响下，并不是每种肠毒素基因都会表达为具有肠毒素功能的蛋白。蛋白质谱分析作为新的研究手段，将成为金黄色葡萄球菌肠毒素蛋白今后探索的方向之一。

［1］金利宗.细菌性食物中毒的临床分析［J］.中外健康文摘，2012，9(8):242-243.

［2］申迹，项锦银，寇巍，洪苏玲.慢性鼻—鼻窦炎中金黄色葡萄球菌肠毒素基因研究［J］.重庆医学，2012，41(30):3134-3136.

［3］柳旭伟，葛文霞.金黄色葡萄球菌肠毒素［J］.微生物学杂志，2008，28(5):86-89.

［4］李自然.上海市食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因多样性及分型研究［D］.上海:上海交通大学，2012.

［5］Jarraud，Peyrat M A，Lim A，et al.A putative nursery of suoerantigens in Staphyococcus aureus ［J］.J Immunol，2001，166(1):669-677.

［6］Becker K，Friendrich A W，Lubritz G.Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantigens and exfoliative toxins among strains of staphylococcus aureus isolated from blood and nasal specimens ［J］.J Clin Microbiol，2003，41 (4):1434-1439.

［7］赵健，丁水军，陆扁，傅丹青.48 株金黄色葡萄球菌的肠毒素分布及其耐药性研究［J］.中国卫生检验杂志，2005，15(7):841-842.