LC-MS法同时测定至灵菌丝胶囊中5种成分的含量*

张先林，戴国梁，丁 康，贡 涛，陈志远，居文政**

江苏省中医院1药学部，2临床药理科，南京 210029；3南京中医药大学第一临床医学院，南京 210029

LC-MS法同时测定至灵菌丝胶囊中5种成分的含量*

张先林1，戴国梁2，丁 康3，贡 涛3，陈志远1，居文政2**

江苏省中医院1药学部，2临床药理科，南京 210029；3南京中医药大学第一临床医学院，南京 210029

目的：建立同时测定至灵菌丝胶囊中腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤含量的方法。方法：采用液相色谱串联质谱（LC-MS）法。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱，流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液，采用电喷雾电离源，多反应离子监测（MRM），用于定量分析的5种成分检测离子对m/z分别为268.1/136、244.2/112.1、284.1/152.1、183.1/69、136.1/119.1。外标法定量分析。结果：5种成分的质量浓度分别在37.5～1200、20～640、40～1280、77.5～2480、27.5～880 ng·mL-1范围内与各自的峰面积呈良好的线性关系（r=0.9985、0.9964、0.9991、0.993、0.9924）。加样回收率在95.7%～101.4%范围内，RSD均低于7.3%。结论：该法专属性强、快速灵敏，可用于至灵菌丝胶囊中5种成分的含量测定。

至灵菌丝胶囊；腺苷；胞苷；鸟苷；甘露醇；腺嘌呤；液相色谱串联质谱法

蛹虫草（Cordyceps militaris（L.）Link）又名北冬虫夏草、北虫草，是由子座（草部分）与菌核（虫的尸体部分）组成的复合体[1]，具有缓解脑溢血和脑血栓、抑制癌细胞生长、增强机体免疫功能、降血糖、抗衰老等[2-3]多种功效。蛹虫草含有腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤等成分[4-5]，且容易人工栽培[6-7]，因此蛹虫草目前被选为冬虫夏草的最佳替代品。

至灵菌丝胶囊主要成分为蛹虫草，该制剂主要具有补肾养肺、固精益气、增强免疫力之功效。本研究旨在建立一种选择性好、快速简便的液相色谱串联质谱法同时测定至灵菌丝胶囊中5种成分的质量浓度，为控制至灵菌丝胶囊的质量提供科学依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

至灵菌丝胶囊（江苏省中医院，批号：1312004、1401002、130203）。标准品：腺苷（批号：13081813，纯度：99.2%）、胞苷（批号：13062509，纯度：98.9%）、鸟苷（批号：13091006，纯度：99.3%）、甘露醇（批号：13110812，纯度：99.5%）、腺嘌呤（批号：13120812，纯度：99.2%），均为成都普瑞法科技开发有限公司提供。甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.2 仪器

Agilent 1290高效液相色谱仪（含Agilent 6430 LC-MS三重四级杆质谱仪，配有电喷雾化离子源（ESI），MassHunter色谱工作站，美国安捷伦公司）；AE240电子天平 （上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷冻离心机（美国Thermo公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（5∶95，v/ v）；流速：200 μL·min-1；柱温：35℃；进样量：2 μL；自动进样方式。离子化模式：正离子；定量模式：多反应监测模式（MRM）；毛细管电压：4000 V；干燥气温度：400℃。确定化合物母离子后，在SIM模式下，对化合物的碎裂电压（Fragmentor）进行优化；母离子发生断裂或重排等反应产生不同的离子碎片。在Product Ion模式下，对化合物母离子施加一定量的碰撞能量（CE），得到其相应的离子碎片，最后在分段多反映离子监测（MRM）模式下，优化目标物离子最佳碰撞能量。腺苷的Fragmentor及CE值分别为100V、20V；胞苷的Fragmentor及CE值分别为100V、10 V；鸟苷的Fragmentor及CE值分别为90V、10 V；甘露醇的Fragmentor及CE值分别为70V、10 V；腺嘌呤的Fragmentor及CE值分别为100 V、30 V；检测对象：腺苷m/z 268.1→m/z 136；胞苷m/z 244.2→m/z 112.1；鸟苷m/z 284.1→m/z 152.1；甘露醇m/z 183.1→m/z 69；腺嘌呤m/z 136.1→m/z 119.1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液 分别取腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤标准品适量，精密称定，用50%甲醇溶解并定容，制成5种成分的质量浓度分别为1200、640、1280、2480、880 ng·mL-1的混合对照品溶液。依次进行倍比稀释，外标法定量分析。结果见表1。

表1 5种成分对照品LC-MS/MS分析浓度信息/ng·mL-1

2.2.2 供试品溶液 取符合胶囊制剂要求的至灵菌丝胶囊内容物，混匀，精密称定0.5 g，置50 mL量瓶中，用90%甲醇溶解并定容，超声处理30 min（功率：45 kHz），摇匀，滤过。精密吸取续滤液1 mL，置5 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。按“2.1”项下试验条件下进行测定，见图1。

图1 液-质联用MRM离子流图

2.3 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下系列混合对照品溶液各2 μL，按照“2.1”项下试验条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X，ng·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表2。结果表明，腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤的质量浓度在相应范围内与峰面积呈良好线性关系。

表2 至灵菌丝胶囊中5种成分的线性回归结果

2.4 精密度试验

取低、中、高3个浓度（选取HB5、HB4、HB2）的混合对照品分别重复进样5次，进样量2 μL，按“2.1”项下实验条件进行测定，记录峰面积。结果腺苷的RSD分别为2.3%、2.7%、3.5%（n=5）；胞苷的RSD分别为1.2%、3.4%、5.1%（n=5）；鸟苷的RSD分别为2.5%、2.6%、3.1%（n=5）；甘露醇的RSD分别为3.5%、1.2%、1.9%（n=5）；腺嘌呤的RSD分别为4.2%、4.3%、3.9%（n=5）。

2.5 稳定性试验

取样品（批号：1312004）5份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温放置于进样室中，分别放置0、4、8、12、24 h按“2.1”项下实验条件进样测定，记录峰面积。结果腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤峰面积的 RSD分别为 1.6%、4.3%、3.8%、2.2%、2.9%（n=5），结果表明供试品溶液在24 h内稳定性均较好。

2.6 重复性试验

取样品（批号：1312004）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下实验条件进样测定，记录峰面积。结果腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤峰面积的RSD分别为1.2%、1.4%、1.6%、2.1%、1.4%（n=6），表明方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品 （批号：1312004）约0.25 g各3份，分别精密加入各对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备，依法测定，计算回收率，结果加样回收率在95.7%～101.4%，RSD均低于7.3%。

2.8 样品含量测定

取3批至灵菌丝胶囊，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样2 μL，并按“2.1”项下条件测定，计算各批胶囊中腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，结果见表3。

表3 至灵菌丝胶囊中5种成分含量测定结果（n=3）/μg·g-1

3 讨 论

本研究前期曾采用高效液相色谱法（HPLC法）检测至灵菌丝胶囊中的成分，但各成分相互干扰严重，无法进行准确的定量分析，多成分含量同时测定色谱条件摸索困难等问题。

通过对不同规格的色谱柱进行比较，结果采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱所得色谱峰保留时间适中，峰形较好。试验中分别尝试采用正、负2种离子模式，发现正离子模式下的离子化效率明显高于负离子模式。同时，考察了流动相的组成与比例对分析结果的影响，结果表明，当甲醇与0.1%甲酸水溶液的比例为5∶95时，5种成分分离良好，彼此不会相互影响，且均在4 min内出峰。

《中国药典》2010版中载有蛹虫草的制剂（金水宝胶囊、金水宝片），仅采用HPLC法测定其中腺苷的含量，而本研究采用LC-MS/MS法同时测定至灵菌丝胶囊中腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，该方法具有干扰少、分析时间短、灵敏度高、专属性强的特点，为科学控制至灵菌丝胶囊质量提供了可靠而简捷的方法。

[1] 郑婷婷，李多伟，王英娟，等.蛹虫草液体培养条件优化及有效成份含量分析[J].菌物研究，2004，2（4）：22-4.

[2] 凌建亚，孙迎节，吕 鹏，等.虫草属真菌中虫草素的超声波提取及其毛细管电泳测定 [J].菌物系统，2002，21（3）：394-7.

[3] 夏春雨，孙 巍，刘学铭.虫草有效成分的研究进展[J].中国食用菌，2009，28（2）：3-6.

[4] 贡成良，吴友良，朱军贞，等.家蚕蛹虫草的人工培育及其成分分析[J].中国食用菌，1989，12（4）：21-4.

[5] 刘静明，钟裕容，杨 智，等.蛹虫草化学成分研究[J].中国中药杂志，1989，14（10）：32-6.

[6] 张红霞，吴 畏，陈 伟，等.北冬虫夏草发酵液中虫草素和腺苷含量的HPLC分析[J].上海农业学报，2005，21（4）：53-7.

[7] 王 莹，铁 梅，康平利，等.ICP-MS等三种测定蛹虫草硒含量方法的比较 [J].光谱学与光谱分析，2009，29（3）：815-8.

Simultaneous Determination of Five Components in Zhiling Junsi Capsules by LC-MS*

ZHANG Xian-lin1,DAI Guo-liang2,DING Kang3,GONG Tao3,CHEN Zhi-yuan1,JU Wen-zheng2**
1Department of Pharmacy,2Department of Clinical Pharmacology,the Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine(TCM),Nanjing 210029;3First School of Clinical Medicine,Nanjing University of TCM,Nanjing 210029

Objective:To develop an LC-MS method for the determination of adenosine,cytidine, guanosine,mannitol and adenine in Zhiling Junsi capsules.Methods:Isocratic elution was carried out with mobile phase consisting of methanol-0.1%formic acid.The separation was performed on Agilent Zorbax SB-C18column,and the mass spectrometer was operated in the positive electrospray ionization (ESI)mode using multiple reaction monitoring(MRM)for the analysis of five components.The precursor to product ionm/ztransitions monitored for adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine were 268.1/136,244.2/ 112.1,284.1/152.1,183.1/69 and 136.1/119.1,respectively.An external standard method was used for quantitation.Results:Adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine were all analyzed exactly,the linear ranges were 37.5-1200,20-640,40-1280,77.5-2480 and 27.5-880 ng·mL-1,respectively.The linear coefficients were 0.9985,0.9964,0.9991,0.9935 and 0.9924,respectively.The recoveries of the five analytes ranged from 95.7%to 101.4%and the relative standard deviations were all within 7.3%.Conclusions:A sensitive,accuracy and suitable LC-MS method has been developed,and the method can be applied for the determination of adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine in Zhiling Junsi capsules.

Zhiling Junsi Capsule;Adenosine;Cytidine;Guanosine;Mannitol;Adenine;LC-MS

R927.2

A

1673-7806（2015）06-543-03

科技部重大新药创制科技重大专项 （No.2012ZX-09303009-002）；江苏省中医药领军人才（LJ200906）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（ysxk-2010）

张先林，男，本科，副主任中药师，研究方向：医院药学E-mail:CL19890525@126.com

**通讯作者居文政，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药临床药代动力学 E-mail:wzhju333@163.com

2015-08-26

2015-11-09