UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中氯沙坦、氨氯地平和辛伐他汀的浓度*

李三妮，张古英，韩 华河北省儿童医院药剂科，石家庄 05003；河北省人民医院妇一科，石家庄 05005

UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中氯沙坦、氨氯地平和辛伐他汀的浓度*

李三妮1，张古英1，韩 华2
1河北省儿童医院药剂科，石家庄 050031；2河北省人民医院妇一科，石家庄 050051

目的：建立了UPLC-MS/MS同时测定人血浆中氯沙坦、氨氯地平和辛伐他汀浓度的方法。方法：取血浆0.2 mL，经甲醇沉淀蛋白后，用Acquity UPLC BEH C18柱，以乙腈-0.1%氨水溶液（v/v）为流动相，梯度洗脱，经电喷雾离子化后进入质谱仪，以多反应监测（MRM）方式进行检测。结果：用于定量分析的离子反应分别为m/z 423.2→207.1（氯沙坦）、384.3→231.2（氨氯地平）、419.3→199.1（辛伐他汀）和409.2→238.1（哌唑嗪）。氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀的最低定量下限分别为0.08、0.35、0.40 ng·mL-1。结论：本法专属性高、分析速度快、操作简便，适用于上述药物的血药浓度监测和药代动力学研究。

液相色谱-串联质谱法；辛伐他汀；氨氯地平；氯沙坦；人血浆

高血压与血脂异常是目前公认的两大心脑血管疾病的重要危险因素，大量流行病学研究证实，这两种危险因素往往合并存在且相互影响[1-3]，在我国约有4800～8000万高血压患者同时患有高血脂[4-5]。抗高血压药和降脂药，特别是氨氯地平、ARB类抗高血压药和他汀类联合用药，与其它联合用药相比，能降低患者致死性冠心病和非致死性心肌梗死发作的相对风险[6-8]。氨氯地平、氯沙坦和辛伐他汀是目前临床上较为常用的联合给药方案。

目前，未见同时测定人血浆中辛伐他汀、氨氯地平和氯沙坦浓度的HPLC-MS方法，仅有单独检测上述药物浓度的方法[9-18]，且这些方法的前处理复杂、分析时间长。本文采用甲醇直接沉淀蛋白，建立了UPLC-MS/MS同时测定人血浆中辛伐他汀、氨氯地平和氯沙坦浓度的方法，分离时间小于3 min，可以用本法同时监测这3种药物的血药浓度。

1 实验部分

1.1 仪器与试药、试剂

Waters Acquity H-class超高效液相色谱仪；Waters Xevo TQ-S三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子源（ESI）以及Masslynx 4.1数据采集软件。

辛伐他汀 （批号：100601-201003）、氨氯地平（批号：100374-201204）、氯沙坦 （批号：100597-201102）和哌唑嗪（IS）标准对照品均购于中国食品药品鉴定研究院。乙腈为色谱纯；水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Acquity BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；流动相：乙腈-0.1%氨水溶液，梯度洗脱，0～1.6 min，乙腈20%～90%，1.6～2.5 min，乙腈保持90%不变，2.6～4 min，乙腈比例为20%；流速：0.5 mL·min-1；柱温：40℃；进样量：2 μL。

1.2.2 质谱条件 离子源：ESI；检测方式：正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）；扫描时间为：0.04s；去溶剂气：N2；去溶剂气温度：450℃；去溶剂气流速：1000 L·h-1；源温度：150℃；其他参数见表1。

1.2.3 血浆样品预处理 精密吸取血浆样品200μL，精密加入哌唑嗪内标溶液10 μL（19.8 ng·mL-1），涡旋混合30 s后，加入甲醇600 μL，涡旋4min，14000 g离心10 min，取上清液2 μL进样分析。

1.2.4 标准曲线与质量控制（QC）样品的制备 精密量取空白人血浆180 μL，置于1.5 mL离心管中，精密加入各待测物系列标准溶液20 μL（溶剂为水），配制相当于氯沙坦浓度为 0.0804、0.402、0.804、4.02、20.1、100.5 ng·mL-1的血浆样品，相当于氨氯地平浓度为0.3452、0.6904、3.452、17.26、43.15、86.3 ng·mL-1的血浆样品，相当于辛伐他汀浓度为0.4056、0.8112、2.028、4.056、20.28、50.7 ng·mL-1的血浆样品，均按“1.2.3”项下的方法处理，制备标准曲线。以血浆中待测物的质量浓度为横坐标，以待测物与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算（权重1/X2），求得直线回归方程，即为标准曲线。制备低、中、高3个浓度的质量控制样品（QC），氯沙坦为0.1608、2.01、10.05 ng·mL-1，氨氯地平为0.3452、1.726、8.63 ng·mL-1，辛伐他汀为0.4056、2.028、10.14 ng·mL-1。

2 结 果

2.1 质谱分析

采用正离子检测方式，在一级全扫描质谱图中获得氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀和哌唑嗪准分子离子峰 [M+H]+的m/z分别为423.2、409.2、419.3、384.3，选择性对[M+H]+峰进行二级质谱分析，准分子离子裂解生成的主要碎片离子见图1。选取响应最高的主要碎片离子用于定量分析；选取响应次高的主要碎片离子计算离子比，用于定性分析，见表1。

2.2 方法的专属性

取空白人血浆200 μL，除不加内标外，均按“1.2.3”项下的方法操作，进样，得提取离子色谱图2A；将一定浓度的待测物标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作，得色谱图2B和图2C，各物质的保留时间见表1，结果表明，无内源性物质干扰测定。氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀的离子比（定量离子对与定性离子对峰面积之比）分别为1.10～1.23、1.68～1.86、1.54～1.72。

2.3 线性范围

氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀的线性范围见表2。所测物质线性关系良好，标准曲线上各点的相对误差（RE）均小于15%，符合测定要求。

2.4 方法回收率和精密度

按“1.2.3”项下操作，制备各待测物3个浓度的QC样品，每个浓度进行6份样本分析，连续测定3 d，并与标准曲线同时进行测定，以当日的标准曲线计算QC样品的浓度，算得各药物的方法回收率为92.2%～103.7%，日内日间精密度 （RSD）均小于13.8%。实验数据表明建立的UPLC-MS/MS分析方法符合生物样品的分析要求。

图1 氯沙坦（A）、氨氯地平（B）、辛伐他汀（C）和哌唑嗪（D）[M+H]+的二级全扫描质谱图

2.5 提取回收率与基质效应

取人空白血浆200 μL，加入相应浓度的质控和内标溶液，均按“1.2.3”项下的方法操作，取上清液进样分析得峰面积A；取人空白血浆，除不加系列标准溶液和内标外，均按“1.2.3”项下的方法操作，取上清液780 μL中加入内标溶液和相应浓度的质控溶液，涡旋混合，取2 μL进样分析，获得相应的峰面积B；取流动相780 μL，加入内标溶液和相应浓度的质控溶液，涡旋混合，取2 μL进样分析，获得相应的峰面积C。以A/B考察方法的回收率，以B/C考察方法的基质效应，氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀、哌唑嗪的回收率均值（n=5）分别为110.3%、106.1%、102.9%、98.4%；基质效应 （n=5）分别为94.6%、92.7%、76.3%、95.0%。结果表明，各药物的回收率良好，除辛伐他汀外的其它物质均不存在基质效应。

图2 氯沙坦（A）、氨氯地平（B）、辛伐他汀（C）和哌唑嗪（D）的典型色谱图

表2 氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀的线性范围及回归方程

2.6 稳定性试验

按“1.2.3”项下操作，制备低、中、高3个浓度的QC样品，按“1.2.3”项下的方法操作，考察血浆样品经预处理后于4℃条件下放置的稳定性、血浆样品于室温下放置的稳定性以及血浆样品经过3次重复冻融及长期放置的稳定性。结果表明，血浆样品经预处理后在4℃条件下放置12 h、血浆样品于室温下放置2 h的稳定性良好；经过3次重复冻融保持稳定；在-40℃条件下存放30 d内稳定。

3 讨 论

在选择流动相时，曾考察了0.1%甲酸、10 mmol· L-1甲酸铵（pH 3.8）及0.1%氨水溶液，结果发现待测物质在0.1%氨水溶液中响应最高，且信噪比（S/N）最大，这表面上与一般认为酸性条件下正离子模式响应较高的经验不相符合。这说明液相分离过程对待测物的检测产生了影响，因为这些药物都具有一定的碱性，在碱性条件下分离，色谱峰峰宽窄，且有机相比例相对较大，有利于提高物质的离子化效率。在测定氯沙坦时发现，其在负离子模式下也响应（定量离子对421.2→179.0），虽然噪音很低，但仍不及在正离子模式下灵敏度高，故最终测定时选择在正离子模式下测定。在研究药物的基质效应时，发现沉淀蛋白后的血浆基质对辛伐他汀存在负效应，但由于方法回收率和精密度均在可以接受的范围之内，且前处理简单，因此本法也适合辛伐他汀的测定。

文献报道，成人服用氯沙坦后的最大血药浓度为50～226 ng·mL-1[11-12]，服用氨氯地平后的最大血药浓度为2.3～6.2 ng·mL-1[13-16]，服用辛伐他汀的血药浓度为4.6～11.2 ng·mL-1[17-18]，故按照至少测定其最大血药浓度的1/10～1/20的原则，本法可以用于药代动力学的研究。加之本法专属性高，操作简单，特别适合于临床上高血压合并高血脂病人联合用药的药物监测。

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本期继续教育试题答案：CDBAD DAAAC

学习测试

将问题页剪下后答题，复印无效（累计5期答题页一并寄回编辑部，可授予Ⅱ类学分证书5分）

1、皮肤涂药不考虑下列哪项差异（因素）？ （ ）

A.皮层厚薄差异

B.年龄不同

C.血型差异

D.肤质不同

2、一般湿疹病程主要分期不包含下列哪项？ （ ）

A.急性期

B.亚急性期

C.慢性期

D.潜伏期

3、下列选项中哪项为皮肤厚度最薄处？ （）

A.掌砳足后皮肤

B.腋下、阴囊等皱褶处皮肤

C.面部皮肤

D.腹部皮肤

4、下列关于外用剂型不正确的表述？ （）

A.仅起一个药物载体作用

B.对炎症皮肤起到散热，消炎，收敛，保护，软化等多种功能

C.适当剂型可协助药物控制皮损，缩短病程

D.有些剂型乳膏可以缓解皮肤干痒等症状

5、皮肤炎症急性期一般不选用什么剂型？ （ ）

A.溶液剂 B.水溶液混悬剂

C.乳剂 D.混悬型油剂

6、皮肤炎症亚急性期一般不选用什么剂型？ （ ）

A.混悬型油剂

B.乳剂膏

C.凝胶，糊剂

D.溶液剂

7、皮肤炎症慢性期一般选用什么剂型？ （）

A.糊剂，软膏

B.溶液剂

C.乳剂

D.混悬型油剂

8、关于不同浓度的外用药作用的错误表述有哪些项？ （ ）

A.不同浓度药物对皮肤的药理作用类型都相同

B.适用于不同疾病的治疗

C.满足不同部位皮肤耐受药物程度的选择需要

D.不同浓度维A酸对皮肤可能产生双向调节作用

9、外用药调配治疗使用错误的项目？ （）

A.液体与膏药合用，应先涂药膏，待皮肤吸收后再涂液体

B.寻常性痤疮可白天使用过氧苯甲酰凝胶，晚上使用易光敏化的维A酸

C.酒精制剂与乳膏联合使用，提高药物促透性

D.联合使用萘替芬与酮康唑可抗真菌

10、激素类外用药使用一般原则？ （）

A.严重皮损最长不能超过3周

B.外用超强激素一日2次，最长不能超过2周

C.外用激素能降低毛细血管通透性，减轻炎症水肿渗出，促进炎症消退，但不只有抗过敏作用

D.激素药膏包封治疗可用于神经性皮炎、疥疮结节等皮肤病

An UPLC/MS/MS Method for Simultaneous Determination of Losartan,Amlodipine and Simvastatin in Human Plasma*

LI San-ni1,ZHANG Gu-ying1,HAN Hua2
1Children's Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050031;2Hebei General Hospital,Shijiazhuang 050051

Objective:To develop an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of losartan, amlodipine and simvastatin in human plasma.Methods:After adding methanol to 0.2 mL plasma,the mixture was deproteinized by methanol,and aliquots of the supernatant were injected into an LC-MS/MS system.The separation was achieved using a C18based column(Acquity UPLC BEH C18)with a mobile phase of acetonitrile and 0.1%aqueous ammonia.Detection was carried out by mass spectrometry equipped with ESI source in a multiple reaction monitoring (MRM)mode.Results:The MRM transitions of m/z 423.2→207.1,384.3→231.2,419.3→199.1 and 409.2→238.1 were used to quantify losartan,amlodipine,simvastatin and prizosin,respectively.The lower limits of quantitation for losartan,amlodipine and simvastatin were 0.08 ng·mL-1,0.35 ng·mL-1and 0.40 ng·mL-1,respectively.Conclusion:The LC-MS/MS method is selective,rapid and simple for therapeutic drug monitoring and clinical pharmacokinetic study of these drugs.

LC-MS/MS;Losartan;Amlodipine;Simvastatin;Human plasma

R969.1

A

1673-7806（2015）06-539-04

河北省医学科学研究重点课题计划（No.20150568）

李三妮，女，药理学硕士，主管药师，研究方向：临床药学及药动学方向 E-mail:sannidezhi@163.com

2015-06-05

2015-11-11