缺血后处理对大鼠心肌缺血/再灌注不同时相损伤营救激酶及线粒体通透性转换孔的影响

肖　军,黎　立,姜振宇,史迎昌,孙佳增,刘维全,孙慧娜,陶耀兵

(1.解放军第三○九医院 a.心内科,b.动物实验中心，北京新技术公司100091; 2.中国农业大学生物学院，北京 100091)



缺血后处理对大鼠心肌缺血/再灌注不同时相损伤营救激酶及线粒体通透性转换孔的影响

肖军1a,黎立1b※,姜振宇1b,史迎昌1b,孙佳增2,刘维全2,孙慧娜1a,陶耀兵1a

(1.解放军第三○九医院 a.心内科,b.动物实验中心，北京新技术公司100091; 2.中国农业大学生物学院，北京 100091)

再灌注治疗是挽救缺血心肌细胞的最有效方法，但同时也可导致再灌注损伤[1]。2003年，Zhao等[2]进行犬实验并提出缺血后处理的概念：在冠状动脉再灌注开始时实行短暂、重复的开通及再闭(冠状动脉3轮30 s阻塞/30 s再灌注)，随后恢复冠状动脉血流，对改善心肌再灌注损伤有益。研究证实，缺血后处理的心肌保护作用与其抑制线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放和激活再灌注损伤营救激酶途径有关[3]。本研究应用近交系Lewis大鼠颈部异位心脏移植左心作功心肌梗死模型，探讨缺血后处理对大鼠移植心脏心肌缺血/再灌注不同时相再灌注损伤营救激酶途径与mPTP的影响。

1材料与方法

1.1大鼠颈部异位心脏移植左室作功模型制备供受者Lewis大鼠240只(健康雄性近交系，RT-11,合格证号：SCXK-2012-0004,无特定病原体动物级，体质量250～300 g,鼠龄 8～10周，由解放军总参总医院实验动物中心提供)。供心主动脉与受体右颈总动脉的单线连续端侧吻合，供心右上腔静脉与受体右颈外静脉的单线连续端端吻合，供心主肺动脉与左心耳行端侧吻合[4-5]。

1.2动物分组及处理120只受体大鼠存活2 d后，肌内注射速眠新(8 mL/kg)全身麻醉。采用随机数字表法分为移植心脏缺血/再灌注组、缺血后处理组和假手术组，其中假手术组8只大鼠，其余两组分别为56只，每个时相点8只。①缺血/再灌注组(再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d)：用无损伤针在移植心左冠前降支下(以左冠状动脉主干为标志，在左心耳部下方2 mm处进针，3-0丝线穿过心肌表层在肺动脉圆锥旁出针)穿线并通过内径1 mm的乳胶管，收紧线完全阻断左冠状动脉前降支30 min，松解线使血管得到充分再灌注。②缺血后处理组(再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d)：在再灌注前1 min内，迅速给予短暂再通10 s，随之再次阻断10 s，此为1个循环，重复3个循环，共计60 s的后处理循环。③假手术组(假手术24 h)：穿线做套环，但不收紧结扎线。1-0丝线单层关闭切口。术后每日肌内注射青霉素(2万U/kg)和链霉素(15 mg/kg)预防感染共3 d。单笼饲养，每日观察大鼠精神状态，通过视诊和触诊观察移植心脏的搏动情况。

1.3心肌梗死范围的测定经主动脉逆行灌注0.5% Evan′s蓝2～3 mL，游离左心室称重，将无蓝染缺血心肌以滤纸吸干后称重，置于-20 ℃冰冻20 min，将冰冻心脏从心尖至心底横向切成薄片(每片厚度1 mm)5～6片，并浸入37 ℃ 1%氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中孵化30 min。坏死区呈灰白色，非坏死区呈深红色，梗死范围以坏死心肌重量与缺血心肌重量之比表示。

1.4磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(phosphorylation of protein kinase B/AKT，p-AKT)与细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)蛋白表达检测磷酸化蛋白激酶B/AKT、p-ERK1/2用Western blot法，参照文献[6]。

1.5mPTP开放程度检测用分光光度计法，参照文献[6]。用ΔA=ΔA1-ΔA2表示mPTP开放程度，ΔA越小，mPTP开放程度越大。

2结果

2.1心肌梗死范围在再灌注7个时相点，缺血后处理组心肌梗死范围均显著低于相同时间点缺血/再灌注组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),见表1。

表1　两组大鼠再灌注不同时相心肌梗死范围的比较　±s，n=8，%)

2.2心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达假手术组心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达水平分别为(0.44±0.04)和(0.61±0.10)，在再灌注7个时相点，缺血后处理组和缺血/再灌注组心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达显著高于假手术组(均P<0.01)。在再灌注7个时相点，缺血后处理组心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达明显高于相同再灌注时间的缺血/再灌注组(P<0.05)，缺血/再灌注组与缺血后处理组的心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达峰值时间在再灌注24 h。见表2。

2.3心肌细胞mPTP开放程度假手术组心肌细胞线粒体吸光度ΔA为(0.63±0.02)，在再灌注7个时相点，缺血后处理组和缺血/再灌注组心肌细胞线粒体吸光度ΔA著显低于假手术组(均P<0.01)。在再灌注7个时相点，缺血后处理组心肌细胞线粒体吸光度ΔA著显高于相同再灌注时间的缺血/再灌注组(P<0.01)，缺血再灌注组与缺血后处理组的心肌细胞线粒体吸光度ΔA峰值时间在再灌注24 h。见表2。

表2　两组大鼠再灌注不同时相数据比较　±s，n=8)

p-ERK1/2：细胞外信号调节激酶1/2;p-AKT：磷酸化蛋白激酶B/AKT；缺血后处理组和缺血/再灌组各时相间比较及与假手术组比较，均P<0.05；“-”未检测

3讨论

20世纪80年代中期，Murry等[7]提出心肌在经受多次短暂缺血/再灌注后，能在随后的长时间缺血中延迟并减轻心肌损伤，即缺血预处理。Marber等[8]的实验在缺血预处理研究史上是一个重大突破，发现由缺血刺激引发两个不同保护窗,第一个保护窗在缺血预处理后即可产生，并于2～3 h后逐渐减弱，取而代之的第二保护窗(保护强度弱于第一窗)于12～24 h开始出现，并持续2～3 d。2003年，Zhao等[2]在犬冠状动脉再灌注实行短暂(开闭各30 s)、重复(3次)的开通及再闭，随后恢复冠状动脉血流，可减少约44%的心肌梗死面积，减少心肌水肿，减少中性粒细胞的聚集，减少细胞凋亡和改善内皮细胞，提出了缺血后处理的概念[9]。目前研究认为，缺血后处理的心肌保护机制与缺血预处理相似，但是两者有明显不同，预缺血处理在心肌缺血之前，缺血后处理在心肌梗死后。对于缺血后处理的认识远没有对于缺血预处理的认识清楚，大多数文献报道缺血后处理对缺血/再灌注的心肌保护作用局限于心肌再灌注6 h内。Mykytenko等[10]比较再灌注24 h与3 h的心肌梗死范围，发现后处理在再灌注晚期(24 h)仍具有缩小心肌梗死面积作用，但并未进行系列时间节点的比较，也未对机制进行深入探索。

本研究应用近交系Lewis大鼠颈部异位心脏移植左心作功心肌梗死模型，移植心脏相当于在体的Langendorff模型，解决了传统在体模型动物死亡率较高的问题，也保证了(冠状动脉被结扎)移植心脏得到长期较好的灌注，同时避免了移植心脏左心萎缩和血栓。本实验供受者为近交系Lewis大鼠，属同基因心脏移植，因而没有免疫排斥反应问题。本研究动态观测大鼠移植心脏心肌梗死范围、心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达及心肌细胞mPTP开放程度在不同再灌注时间点的数值。在再灌注时间3、6、12、24 h及2、4、7 d，与假手术组比较，缺血/再灌注组和缺血后处理组心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达显著增高(P<0.01)，心肌细胞mPTP开放程度增高(P<0.01)，提示再灌注损伤营救激酶途径及心肌细胞mPTP开放在心肌缺血/再灌注损伤中起重要作用。与缺血/再灌注组比较，缺血后处理组在7个时相点的心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达显著增高(P<0.05)，心肌细胞mPTP开放程度降低(P<0.01)，心肌梗死范围显著缩小(P<0.05)，提示缺血后处理能在再灌注早期(3 h)升高心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表达，有效抑制心肌细胞mPTP开放，有效缩小心肌梗死范围，并持续到再灌注晚期(7 d)。缺血/再灌注组与缺血后处理组的心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表达峰值时间和心肌细胞mPTP开放程度谷值时间在再灌注24 h，提示缺血后处理不能改变心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表达达峰时间及mPTP开放程度达谷时间。本研究表明，缺血后处理能减轻心肌缺血/再灌注损伤的程度，但不能改变(加速或延迟)心肌缺血/再灌注损伤的进程。

缺血后处理是近年来国际上提出的心肌保护全新理念，作为一种内源性心肌保护机制具有重大的研究价值和应用价值。本研究提示，缺血后处理在大鼠心肌缺血/再灌注3 h～7 d内能有效升高心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表达，有效抑制心肌细胞mPTP开放，有效缩小心肌梗死范围。缺血后处理对心肌缺血/再灌注损伤的这种持续保护作用应受到重视，其机制有待深入研究。

参考文献

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[2]Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,etal.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):579-588.

[3]Hausenloy DJ,Yellon DM.New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury:targeting the reperfusion injury salvage kinase(RISK)-pathway[J].Cardiovasc Res,2004,61(3):448-460.

[4]郭宏伟,吴清玉,谢蜀生,等.左心作功的大鼠腹部心脏移植模型的建立[J].中华实验外科杂志,2001,18(2):188.

[5]肖军,黎立,姜振宇,等.缺血后处理对大鼠移植心脏心肌缺血再灌注损伤不同时相保护作用[J].中国循证心血管医学杂志,2014,8(1):104-106.

[6]陈玉培,向许进,闵苏.雷诺嗪后处理对大鼠心肌再灌注损伤营救激酶及线粒体渗透性转换孔道的影响[J].中国药理学通报,2010,26(1):91-94.

[7]Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74(5):1124-1136.

[8]Marber MS,Lathman DS,Walker JM,etal.Cardiac stress protein elevation 24 hours after brief ischemia or heat stress is associated with resistance to myocardial infarction[J].Circulation,1993,88(3):1264-1272.

[9]Raphael J.Physiology and pharmacology of myocardial preconditioning[J].Semin cardiothorac Vasc Anesth,2010,14(1):54-59.

[10]Mykytenko J,Kerendi F,Reeves JG,etal.Long-term inhibition of myocardial infarction by postconditioning during reperfusion[J].Basic Res Cardiol,2007,102(1):90-100.

摘要：目的探讨缺血后处理对大鼠心肌缺血/再灌注不同时相损伤营救激酶及线粒体通透性转换孔(mPTP)的影响。方法建立近交系Lewis大鼠颈部异位心脏移植左心作功模型， 120只受体大鼠存活2 d后，采用随机数字表法分为移植心脏缺血/再灌注组、缺血后处理组和假手术组，其中假手术组8只，其余两组分别为56只，每个时相点8只，在再灌注3、6、12、24 h及2、4、7 d分别检测移植心脏心肌细胞磷酸化蛋白激酶(p-AKT)、细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白表达、mPTP开放程度和心肌梗死范围。结果在再灌注的7个时相点，缺血后处理组与再灌注组心肌细胞p-AKT与p-ERK1/2蛋白表达及mPTP开放程度对应比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，两组蛋白表达及mPTP开放程度均明显高于假手术组(均P<0.05)；缺血后处理组心肌梗死范围显著小于再灌注组(P<0.05或P<0.01)。结论缺血后处理在大鼠移植心脏心肌缺血/再灌注3 h至7 d内能有效升高心肌细胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白的表达，抑制心肌细胞mPTP开放，缩小心肌梗死范围。

关键词:缺血后处理；缺血/再灌注损伤；心肌/再灌注损伤营救激酶；线粒体通透性转换孔

Effect of Ischemic Postconditioning on the Reperfusion Injury Salvage Kinase and Mitochondrial Permeability Transition Pore at Different Time Phases of Myocardial Ischemia-reperfusionon in RatsXIAOJun1a,LILi1b,JIANGZhen-Yu1b,SHIYing-Chang1b,SUNJia-zheng2,LIUWei-Quan2,SUNHui-Na1a,TAOYao-Bing1a.(1a.DepartmentofCardiology, 1b.CenterforAnimalExperiment,309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China; 2.CollegeofBiologicalSciences,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100091,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effects of ischemic postconditioning on the reperfusion injury salvage kinase and the opening of mitochondrial permeability transition pore(mPTP) at different time phases of myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsIsogenic adult Lewis rat models of cervical heterotopic and working-heart transplantation were established. The 120 recipients were divided into ischemia-reperfusion group，ischemic postconditioning group and sham operation group,8 rats in the sham operation group, 56 in the other two groups respectively,8 for each time phase point.Myocardial infarction size,expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein and the opening of mPTP were measured respectively at 3, 6, 12,24-hour and 2,4, 7-day after reperfusion.ResultsThe expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein and the opening of mPTP were statistically significant different between the ischemia-reperfusion group and ischemic postconditioning group at 7 time points after reperfusion(P<0.05),while both of which were higher than the sham operation group.The myocardial infarction range of the postconditioning group was less than the ischemia-reperfusion group(P<0.05).ConclusionIschemic postconditioning can increase the expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein，decrease the opening of mPTP and myocardial infarction range between 3 hours and 7 days after the reperfusion after myocardial ischemia in rats.

Key words:Ischemic postconditioning; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Reperfusion injury salvage kinase; Mitochondrial permeability transition pore

收稿日期：2014-09-01修回日期：2014-11-27编辑：伊姗

基金项目：北京市自然科学基金(7122178)

中图分类号：R541.4
doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.046

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)05-0890-03