慢性HBV 感染者肝组织CD28、CD34表达的研究

吴 敏，徐 龙△，肖影群，杨仙荷，钟青梅，章 萍，王 武

（江西省南昌市第九医院／南昌大学附属感染病医院：1.肝二科；2.病理科 330002）

乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，HBV）为非细胞毒性小分子DNA 嗜肝病毒。它以病毒前体的形式存在于宿主体内。细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic t-lymphocytes，CTL）在病毒清除和乙型肝炎的发病机制中发挥了重要的作用［1-2］。强烈的、多特异性的和持久的T 淋巴细胞介导的免疫反应对病毒感染的控制极其重要［3-5］。在免疫应答过程中CD28／B7共刺激信号缺陷将导致T 细胞的无反应性、免疫耐受，或者凋亡［6-7］。慢性HBV 感染引起肝损伤后，肝窦毛细血管化，CD34可以用作内皮标记评估肝窦毛细血管化程度。抗病毒是治疗慢性乙型肝炎的关键。本研究旨在通过免疫组织化学方法检测慢性HBV 感染者肝组织CD28、CD34的表达强度，探讨其与肝组织炎症活动度及纤维化程度的关系，为抗病毒治疗提供新的参考指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2012年5月至2013年5月收治的慢性HBV 感染者住院病例30例，男23例，女7例，年龄16～55岁，平均（34.9±10.2）岁。其中血清HBeAg阳性者15例，HBeAb阳性者11例，HBeAg及HBeAb均为阴性者4例。按照肝功能变化分为慢性轻度乙型肝炎10例，慢性中度乙型肝炎13例，慢性重度乙型肝炎7例。所有病例均符合中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会制定的《2010年版慢性乙型肝炎防治指南》［8］的诊断标准。排除合并其他肝炎病毒感染患者，排除代谢性、酒精性、自身免疫性肝病及药物性肝损害患者，排除近6个月接受糖皮质激素、胸腺肽治疗等影响免疫功能药物的患者，排除接受抗病毒治疗患者。

1.2 主要实验试剂 兔抗人CD28 多克隆抗体（英国biobyt公司），鼠抗人CD34单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），即用型超敏型（Polink-2）检测试剂盒（通用型kit，北京中杉金桥生物技术有限公司），DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 标本采集与保存 30例入组病例彩超下肝穿定位后床边行肝穿刺获得肝组织，用10%甲醛固定，再用80%、95%、100%乙醇进行梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片。

1.4 方法 常规行HE染色、网状纤维染色及Masson染色。免疫组织化学步骤：石蜡切片脱蜡、水化、修复抗原后，3%H2O2去离子水孵育，分别滴加50μL 一抗（CD28∶抗体稀释剂＝1∶150，CD34∶抗体稀释剂＝1∶50），4 ℃过夜，滴加即用型超敏型（Polink-2）检测试剂（二抗）室温孵育，应用DAB溶液染色，复染，脱水，透明，封片。

1.5 结果判定 肝组织病理学诊断标准参照2000年《病毒性肝炎防治方案》［9］中的慢性肝炎病理分级、分期标准，将炎症活动度（G）划分为0～4 级，纤维化程度（S）划分为0～4 期。CD28免疫组织化学结果判定：阳性细胞染成棕黄色或棕褐色。每切片选取5个高倍视野（×400）读片。染色面积：无阳性细胞为0分，＜25%为1分，26%～＜51%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。染色面积积分与染色强度积分相加所得为最终积分。CD34 免疫组织化学结果判定：CD34 阳性细胞染成棕黄色或棕褐色。参照Weidner校正方法计算肝组织内微血管密度（microvessel density，MVD）。在低倍镜（×10）下选取5个CD34抗体染色最强区域，即微血管数量最多区域，在每一个区域中计数一个高倍镜（×40）下的微血管数，取其平均值即为MVD 值。由两名病理科医师采用双盲法读片。

1.6 统计学处理 实验结果经SPSS17.0录入并用该软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，各组间均数比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝组织病理学检查结果 30例慢性HBV 感染患者中，肝组织均存在不同程度的损害，其中G19 例（30%）、G26 例（20%）、G39例（30%）、G46例（20%）、S19例（30%）、S27例（23.3%）、S35例（16.7%）、S49例（30%）。

2.2 CD28、CD34的表达情况 CD28在所有病例肝组织的汇管区、汇管区周围及小叶内均有表达，其中，G1组与G3组之间、G1组与G4组之间CD28表达积分差异有统计学意义（P＜0.05），S1组与S4组之间、S2组与S4组之间CD28的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。CD34表达在肝窦血管内皮细胞，以汇管 区为主，G1组与G3组 之 间、G1组 与G4组 之 间、G2组与G3组之间、G2组与G4组之间及G3组与G4组之间的差异有统计学意义（P＜0.01），S1组与S2组之间、S1组与S3组之间、S1组与S4组之间及S2与S4组之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、2，图1～4。

表1 CD28和CD34在G1～G4 肝组织中表达 的比较（±s）

表1 CD28和CD34在G1～G4 肝组织中表达 的比较（±s）

组别 n CD28 CD34 G19 2.670±1.000 22.900±9.086 G2 6 3.830±1.329 32.100±8.715 G3 9 4.000±1.658 49.930±14.490 G4 6 4.670±1.366 66.300±7.554 F 2.903 22.996 P 0.054 0.000

表2 CD28和CD34在S1～S4 肝组织中表达的比较（±s）

表2 CD28和CD34在S1～S4 肝组织中表达的比较（±s）

组别 n CD28 CD34 S19 2.890±1.453 22.730±5.360 S2 7 3.140±0.900 39.210±9.733 S3 5 4.000±1.225 47.410±18.148 S4 9 4.780±1.093 57.530±12.306 F 4.414 14.824 P 0.012 0.000

图1 轻度慢性乙型肝炎（G1S1）肝组织中CD28的表达（免疫组织化学×400）

图2 中度慢性乙型肝炎（G3S3）肝组织中CD28的表达（免疫组织化学×400）

图3 轻度慢性乙型肝炎（G1S1）肝组织中CD34的表达（免疫组织化学×400）

图4 重度慢性乙型肝炎（G4S4）肝组织中CD34的表达（免疫组织化学×400）

3 讨 论

CD28分子主要表达于90%CD4＋T 淋巴细胞及50%CD8＋T 淋巴细胞表面。CD28分子的天然配体是B7-1（CD80）和B7-2（CD86）。CD28与B7作用是T 细胞激活所必须的共刺激信号。范振平等［10］研究急性和慢性乙型肝炎外周血淋巴细胞各亚群特点时发现急性乙型肝炎的外周血中CD8＋CD28＋T 细胞的百分比和绝对数比健康人和慢性乙型肝炎都有明显的升高，而慢性乙型肝炎与健康人相比CD8＋CD28＋T细胞明显下降。本试验发现肝组织炎症活动度越高，CD28的表达越强。这说明当CD28表达低下时，CD28与B7相结合所产生共刺激信号减弱，不足以活化T 淋巴细胞。当CD28表达增强时，CTL活化、增殖，IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌增多，肝细胞溶解、破坏，肝组织炎症加重［11］。肝脏损伤之后，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）出现活化反应，转化为肌成纤维细胞，大量合成细胞外基质，肝组织发生纤维化。HSC 活化后可分泌单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）等多种细胞因子［12］，MCP-1 对CD4＋、CD8＋T淋巴细胞具有趋化、诱导作用［13］。本试验结果提示肝组织纤维化程度越高，CD28的表达越强。这说明肝纤维化后释放的MCP-1等细胞因子可以调控细胞免疫的表达，而T 淋巴细胞活化所产生的免疫效应也可以影响肝纤维化的进程，二者相互作用，互为因果。由此说明，肝组织内CD28的表达状态与肝脏组织学改变密切相关，可以作为判断肝组织损伤的一个免疫学指标。

CD34分子是表达于发育早期淋巴造血干／祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞上的表面糖化磷酸蛋白，国内外大量研究发现CD34在正常肝窦中无任何阳性表达，但在血管内皮细胞呈现高表达。因此CD34可以用作内皮标记评估肝窦毛细血管化程度。邵颖等［14］对慢性肝炎患者肝组织进行免疫组织化学CD34染色发现肝窦毛细血管化可能加剧了肝组织炎症的进展。Amarapurkar等［15］对慢性肝病患者进行肝组织活检，发现肝脏纤维化程度越高，CD34阳性率也越高。本试验发现肝组织炎症活动度及纤维化程度越高，CD34 的表达越强。这说明窦壁毛细血管化程度与肝组织炎症活动度及纤维化程度具有同步性。究其原因可能是HBV 感染等病因引起肝脏损伤后，当肝组织仅出现变性或点灶状坏死时，通过肝细胞再生可以修复，当肝组织坏死灶范围较大、较严重时，出现肝索排列紊乱，网状支架塌陷，血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转 化 生 长 因 子-β（transforming growth factor，TGF-β）等细胞因子大量释放，HSC 活化，细胞外基质产生和分泌增加、降解减少，肝窦毛细血管化，肝纤维化形成。因此，肝窦毛细血管化与肝组织病理改变密切相关。CD34作为肝窦毛细血管化的内皮标记，可间接反映肝脏组织炎症及纤维化程度。

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