MMP-7、MMP-9和TIMP-3在骨巨细胞瘤中的表达及临床意义＊

时 燕，姜 锋，卜 今，卢 红△

（1.河南大学淮河医院肿瘤科，河南开封475000；2.河南大学淮河医院骨科，河南开封475000；3.南京医科大学学报编辑部，南京210029）

骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone，GCT）被认为是一种具浸润性生长，易复发的潜在恶性肿瘤，偶出现肺部转移，局部侵袭性生长和术后复发比例均高达40%～50%，国内的发病率为国外的2～3 倍，但是目前其生物学行为尚无法通过GCT 的病理学分级与影像学分型等组织学指标评估［1-2］。近年研究表明，在肿瘤细胞侵袭及在肿瘤新生血管的形成过程中蛋白酶均发挥非常关键的作用，多种肿瘤的侵袭、转移和复发与基质金属蛋白酶（MMP）-7、MMP-9 和金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）-3 的表达不平衡相关［3-4］。本实验旨在通过免疫组织化学法检测MMP-7、MMP-9、TIMP-3 和CD34 在GCT组织中的表达情况，并探讨其与肿瘤血管形成及术后复发的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集淮河医院2000年3月至2008年5月骨外科手术收治的126例GCT 组织标本，其中肿瘤复发病例54例（最短复发时间为3 个月，最长为48 个月，平均为23.8 个月），非复发病例72例（追踪时间长达60 个月，未见复发）；男60 例，女66例，年龄17～65岁，平均（34.8±5.6）岁，按Jaffe分级为Ⅰ级42例，Ⅱ级72 例，Ⅲ级12 例。全部标本均经病理组织学证实。

1.2 方法 MMP-7、MMP-9 鼠抗人多克隆抗体，TIMP-3鼠抗人多克隆抗体和CD34鼠抗人单克隆抗体及通用型SP 检测试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。肿瘤组织标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，冷却，4 ℃保存制成蜡块，4 μm 连续切片，采用SP 法进行免疫组织化学染色，严格按试剂盒说明书进行操作。所有切片常规脱蜡，PBS 冲洗，3% H2O2室温下孵育10min，使内源性过氧化物酶失去活性，微波炉进行抗原修复，正常山羊血清封闭，滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育放置于4 ℃冰箱过夜，然后滴加生物素化二抗及过氧化物酶标记的抗体，PBS 洗，DAB 显色，苏木素对比染色。其中CD34 染色前先行高温高压抗原修复，其余步骤按SP 法进行。以PBS 代替一抗作阴性对照。

1.3 染色结果判断 MMP-7、MMP-9和TIMP-3阳性着色为棕黄色颗粒，位于细胞质或细胞膜。着色程度：着色较深记3 分，着色适中记2分，着色较淡记1分和基本不着色记0分；着色细胞百分率：＞50%记3 分，25%～50%记2分，5%～＜25%记1 分，＜5%记0 分。上述两项相乘，≤1 分为（-），2～4 分为（＋），5～7 分为（＋＋），≥8 分为（＋＋＋）。在高倍镜下随机选择有代表性的5个不同视野计数100 个肿瘤细胞中的阳性细胞数。微血管密度（MVD）计数方法［5］：任何一个孤立的棕黄色内皮细胞或细胞簇，均按独立的微血管计数，不以有无血管腔及有无红细胞作为判断微血管的依据，已形成肌层的血管及分辨不清或染色模糊的细胞不计数。先在低倍镜视野内确定肿瘤组织内微血管高密度的区域，再通过400倍镜观察计数，最后取5个视野内微血管数目的平均值进行分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0 软件进行统计学分析，组间采用χ2检验分析，与MVD 的相关性采用Spearman相关分析处理，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MMP-7、MMP-9和TIMP-3 在GCT 组织中的表达 如图1所示，免疫组织化学染色显示MMP-7、MMP-9表达主要在多核巨细胞，在细胞质内分布不均匀，而在肿瘤与周围组织交界处呈现高表达，另在单核基质细胞质内可见有极少部分表达。TIMP-3则大部分表达于单核基质细胞及多核巨细胞的胞质和胞膜中，在肿瘤周围成骨细胞和骨细胞也可见其表达。而CD34 表达于内皮细胞。由表1结果显示，MMP-7、MMP-9和TIMP-3 阳性率分别为97.6%、100.0%和92.8%。在复发组和非复发组间比较，MMP-7、MMP-9 表达和MVD 差异显著（P＜0.01），TIMP-3表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 MMP-7、MMP-9、TIMP-3 表达与MVD 的相关性 经Spearman相关分析显示，MMP-7、MMP-9 表达与MVD 存在正相关性（r＝0.895，P＝0.001；r＝0.271，P＝0.025），TIMP-3表达与MVD 不存在相关性（r＝-0.368，P＝0.063）。

图1 GCT 组织免疫组织化学染色（×100）

表1 MMP-7、MMP-9、TIMP-3和MVD 在GCT 中的表达情况

3 讨 论

GCT 是一种潜在的恶性肿瘤，具有低度侵袭性。目前在临床病理诊断中尚没有找到对治疗和预后判断有明显指导意义的生物学行为指标［6］。而部分患者往往由于手术方式不当，出现手术预后差，复发较多，严重影响患者的生活质量。因此，在判断该肿瘤的生物学行为时迫切需要有一种可靠的指标来为临床治疗提供帮助。

本实验应用多克隆抗体进行免疫组织化学间接法染色对GCT 中的MMP-7、MMP-9 和TIMP-3的表达量进行原位观察。观察结果显示在特定的组织部位均有特异性的免疫组织化学染色棕黄色阳性反应物的存在。如在多核巨细胞中MMP-7和MMP-9的量表达较多，在单核基质细胞胞质内表达量极少；TIMP-3则集中表达于单核基质细胞及多核巨细胞的胞质和胞膜中。然而相反，在对照组切片中没有观察到阳性反应物。由此表明，可以运用免疫组织化学方法成功地检测出MMP-7、MMP-9和TIMP-3 在组织中的分布，弥补了许多诊断方法的不足。

MMP能介导肿瘤恶性生物过程的发生，是一类与肿瘤的侵袭和转移密切相关的蛋白水解酶。它不仅直接参与破坏组织，还诱导生成血管内皮细胞生长因子（VEGF），进而刺激内皮细胞合成蛋白酶，致使内皮细胞的增殖和转移，被认为是人体内重要的血管生成诱导和调控因子［7］。Matsuura等［8］研究表明，MMP-7 的mRNA 在间叶软骨肉瘤中呈低表达，而MMP-14的mRNA 表达较高。Mak等［9］研究发现，MMP-13是降解Ⅰ型胶原的重要酶，主要表达于GCT 的间质细胞中，Runx2siRNA 参与其表达的调节作用。Cowan 等［10］的研究表明，在GCT 中，MMP-13 的表达量远远高于MMP-1，而MMP-8 不表达。因此，在GCT 中MMPs不同的亚型出现不一致表达，其原因目前还不清楚。MMP-7 是降解构成ECM和BM 的重要成分，它在基质细胞中不表达，而在正常黏膜上皮细胞中呈弱表达或不表达。MMP-9属于Ⅳ型胶原酶，在肿瘤浸润转移过程中，发挥蛋白水解酶的作用，主要是通过降解以Ⅲ型、Ⅳ型胶原为主要成分的细胞外基质和血管壁基膜的形式，并参与肿瘤血管的形成，多种肿瘤的恶性行为和预后与其表达升高有关［3，11-12］。本研究结果也显示，MMP-7、MMP-9 的表达在复发组中均比非复发组要高，肿瘤血管形成在复发组也高于非复发组，而MMP-7、MMP-9 的表达均与MVD 呈正相关。

TIMP-3是一种能紧密结合细胞外基质成分的非可溶性蛋白，在局部发挥作用，能比其他成员更有针对性的抑制MMP 活性及发挥其他生物学功能［13］。TIMP-3 按一定比例与MMP-9形成特异性复合物，首先通过抑制MMP-9活性阻止细胞外基质的降解及促血管的生成，然而使内皮细胞的增殖和转移得到抑制。同时TIMP-3 还能抑制肿瘤血管形成，肿瘤的发展，其主要是通过抑制微血管内皮细胞对生长因子的反应，调节细胞增殖、促进细胞凋亡［14］。有关肺癌、前列腺癌等多种肿瘤的研究显示，肿瘤细胞侵袭转移能力与产生MMP-9的能力关系密切，通过选择性地对MMP-9 表达抑制或TIMP-2、TIMP-3 表达增强均可在一定程度上使肿瘤侵袭转移得到抑制［4］。吕国丽等［15］通过TIMP-3 基因启动子的甲基化实验，得出GCT TIMP-3 低表达可促进肿瘤的发展，但也有研究［3］显示在部分肿瘤中TIMP-3 高表达。在本实验研究中，TIMP-3 在GCT 中的阳性表达率为92.8%，而复发组与非复发组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。这可能是TIMP-3与肿瘤的增殖存在一定的关联，但目前还不能考证其与肿瘤是否复发之间的关系。本实验结果也显示，虽然在GCT 复发组中TIMP-3和MMP-9 二者表达的失衡，TIMP-3无明显升高，而MMP-9 高表达，这可能是由于其促进肿瘤细胞局部浸润生长、肿瘤血管形成并导致肿瘤复发。MMP-7 与TIMP-3 之间的相关性有待进一步研究。综上所述，建议对GCT MMP-7、MMP-9和MVD 进行检测，其高表达则对预示复发有一定指导作用。

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