ASAP1蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义

张　婷,刘文俊

(武汉市汉口医院 a.检验科 b.病理科,武汉 430012)



ASAP1蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义

张婷a※,刘文俊b

(武汉市汉口医院 a.检验科 b.病理科,武汉 430012)

摘要：目的检测乳腺癌组织中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)蛋白的表达,探讨ASAP1与乳腺癌发生的相关性,为乳腺癌的防治寻找新的靶点。方法采用单纯随机抽样选取2008年6月至2012年6月武汉市汉口医院就诊乳腺癌患者41例，进行免疫组织化学检测并分析乳腺癌组织中增殖细胞相关核抗原Ki67、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达与ASAP1的相关性；比较不同转移能力乳腺癌细胞株中ASAP1与HER2水平；检测RNA干扰抑制ASAP1对MDA-MB-231细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响，对照组MDA-MB-231细胞培养体系中加入阴性对照干扰小RNA。结果免疫组织化学显示乳腺癌组织中HER-2的表达与ASAP1无相关性(P=0.803),Ki67和MMP-2的表达与ASAP1有显著相关性(P=0.035;P=0.013)；免疫印迹显示高侵袭力乳腺癌细胞中ASAP1高表达,低侵袭力乳腺癌细胞ASAPI呈弱表达(P<0.01)，HER-2的表达与ASAP1无相关性(P>0.05)；RNA干扰抑制MDA-MB-231细胞中ASAP1的表达,VEGF水平显著低于对照组(P<0.01)。结论乳腺癌组织中ASAP1的表达与肿瘤细胞的增殖和转移存在相关性,ASAP1有望成为乳腺癌的治疗靶点 。

关键词:乳腺癌；ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1； 增殖细胞相关核抗原Ki67；基质金属蛋白酶2；人表皮生长因子受体2

肿瘤的形成是一个多步骤、多阶段的复杂过程,在此过程中, 增殖细胞相关核抗原Ki67(proliferating antigen Ki67)、基 质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表达与肿瘤细胞的增殖、转移和疗效预后相关[1-4],ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ArfGAP with SH3 domain,ankyrin repeat and PH domain 1,ASAP1)是近年来新发现的一类肿瘤相关蛋白,其在乳腺癌中的临床价值有待深入研究。本研究通过分析乳腺癌组织中ASAP1与Ki67、MMP-2、HER2表达的相关性,并在乳腺癌细胞系中观察ASAP1表达与肿瘤细胞转移的相关性及对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,为乳腺癌的防治研究提供线索。

1材料与方法

1.1标本来源41例乳腺癌标本取自2008年6月至2012年6月武汉市汉口医院收治的原发性乳腺癌患者手术切除组织。患者均为女性,年龄31～67岁,平均(48±8)岁,术前未做化疗和放射治疗。

1.2细胞株乳腺癌细胞系MDA-MB-231、SKBR3及MCF-7购自武汉大学细胞典藏中心。

1.3主要试剂和仪器免疫组织化学一抗ASAP1(ab12423,产品批号：Ab100114001)、Ki67(RB-9043,产品批号：091215405F)、MMP-2(MAB-0244,产品批号：100124307A)及HER-2(RAB-0156,产品批号：091120204K)分别购自英国abcam 公司和福州迈新生物技术开发有限公司。二抗购自Pierce公司(产品批号：100507299)。ASAP1 干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)(sc-41695,产品批号：sc-100102695)购自美国Santa Cruz公司,VEGF检测试剂盒购自晶美公司(产品批号：090920204c)。HH.CP-01型二氧化碳培养箱购自中国上海博讯公司，165-8001型垂直电泳槽购自美国BIO-RAD公司； HC-2518R高速冷冻离心机购自安徽科大创新公司(离心半径 6 cm)；BSG-4型生物安全柜购自中国珠海再鑫公司。

1.4方法

1.4.1免疫组织化学标本均由10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋、切片和染色,一抗稀释度(1∶500)。首先观察其病理形态学改变,然后应用免疫组织化学(SP法)检测Ki67、MMP-2和HER2的表达与ASAP1在41例乳腺癌细胞中的表达情况。另取癌旁非肿瘤的正常组织石蜡标本为对照。阳性结果判断：着色部位棕黄色颗粒为阳性,并以阳性细胞比率为主，记为-(不着色)、+(0～25%)、++(25%～50%)、+++(>50%),其中-～+为低表达,++～+++为高表达。

1.4.2Western blot分别离心收集对数生长期的MDA-MB-231、SKBR3及MCF-7细胞,磷酸盐缓冲液洗涤,蛋白提取缓冲液充分裂解,4 ℃,15 000 r/min离心10 min,收集上清。蛋白定量后,10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离,转膜,5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜。分别加一抗Ki67、MMP-2和HER2的表达与ASAP1；二抗；电化学发光法系统显影。

1.4.3siRNA检测用Lipofectmine2000试剂转染对照siRNA,ASAP1 siRNA至MDA-MB-231细胞,48 h后离心收集细胞,磷酸盐缓冲液洗涤。部分细胞用Trizol试剂提取RNA进行半定量反转录-聚合酶链反应和1.5%琼脂糖凝胶电泳,其余细胞用蛋白提取缓冲液裂解,离心收集上清,进行后续的蛋白质印迹检测。

1.4.4VEGF检测收集细胞培养物上清,3000 r/min,离心20 min,采用酶联免疫吸附测定法检测,具体操作见试剂盒说明书,检测重复3次。

2结果

2.1乳腺癌组织中ASAP1表达与Ki67、MMP-2和HER2的相关性免疫组织化学显示，ASAP1主要表达在细胞质或膜表面中,正常组织为阴性或低表达,乳腺癌组织可呈阳性或强阳性(图1),41例乳腺癌患者癌基因HER2表达与ASAP1表达水平无相关性(P=0.803)；而Ki67表达与ASAP1表达水平显著相关,其中20例Ki67高表达标本中有15例ASAP1高表达,21例Ki67低表达标本中有8例ASAP1高表达(P=0.035)； MMP-2高表达与ASAP1表达水平显著相关(P=0.013),其中21例MMP-2高表达标本中有17例ASAP1高表达,20例MMP-2低表达标本中有8例ASAP1高表达。 见表1。

图1乳腺癌组织中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)的表达(二氨基联苯胺染色×200)1A：ASAP1(+++)；1B：ASAP1(++)；1C：ASAP1(+)；1D：ASAP1(-)

2.2ASAP1表达对乳腺癌细胞侵袭性的影响免疫印迹检测显示ASAP1表达水平高侵袭力乳腺癌细胞MDA-MB-231中为(0.76±0.09)，低侵袭力乳腺癌细胞SKRB3表达水平为(0.37±0.07),MCF-7表达水平为(0.31±0.05),高侵袭力乳腺癌细胞MDA-MB-231表达水平显著高于低侵袭力乳腺癌细胞SKRB3和MCF-7(F=35.180，P<0.01)；而HER2在三种细胞的表达依次为(0.33±0.05)、(0.67±0.11)和(0.23±0.07)，ASAP1的表达与HER2无显著相关性(r=0.20，P=0.599)(图2)。

2.3siRNA抑制ASAP1对MDA-MB-231细胞ASAP1蛋白表达的影响干扰组ASAP1的基因相对表达水平为(0.37±0.13)，对照组ASAP1的基因相对表达水平(0.72±0.21)，干扰组ASAP1的基因相对表达水平显著低于对照组(t=-6.060,P=0.020); 干扰组ASAP1蛋白相对表达水平(0.33±0.07)，对照组ASAP1蛋白相对表达水平为(0.63±0.11)，干扰组ASAP1蛋白相对表达水平显著低于对照组(t=12.990,P=0.010)(图3)。

2.4RNA干扰抑制ASAP1对MDA-MB-231细胞 VEGF表达的影响ASAP1被抑制后,MDA-MB-231细胞培养上清液中干扰组VEGF为(59±21 ) μg/L，显著低于对照组[(182±35) μg/L](t=56.90,P<0.05)。

3讨论

转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征,在此过程中,肿瘤细胞需要穿越组织屏障,才能向周围侵袭和转移。研究发现MMP-2具有降解细胞外基质和基膜的功能,MMP-2高表达与肿瘤的转移和侵袭相关[1-2],而肿瘤的转移往往伴随着细胞的活跃增殖,目前公认的反映肿瘤细胞增殖力的指标是Ki67抗原,Ki67是一种存在于增殖细胞中的细胞核抗原,其表达水平与肿瘤增殖的活跃程度及预后呈正相关[3]。我国每年新诊断为乳腺癌的患者已增至近17万人,尽管Herceptin针对HER2过度表达乳腺癌的靶向治疗已取得明显疗效,但由于高额的治疗费用和耐药性的发生[5],每年死亡人数仍近4万人,因此乳腺癌的疗效和预后的研究显得尤为重要。近年来先后在卵巢癌、前列腺癌及胃癌等肿瘤中发现一类新的反映肿瘤转移和侵袭的蛋白ASAP1,它是Arf-GTP酶的受体,参与细胞膜转运和骨架蛋白的重构[6-8],ASAP1与乳腺癌相关性的研究国内目前少有报道,本研究在临床乳腺癌病理组织中对HER2、Ki67及MMP-2与ASAP1表达相关性进行了分析,结果显示ASAP1不仅与乳腺癌细胞转移相关,而且还是细胞增殖的指标,值得关注的是在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中均发现ASAP1的表达与乳腺癌基因HER2的表达无相关性，这一现象国内外文献均少见报道,推测HER2与ASAP1的表达缺乏共同的信号调控通路,说明HER2与ASAP1均高表达的乳腺癌在治疗上将更加困难,因为同一类药物可能无法同时抑制HER2与ASAP1的表达；由于已经报道的ASAP1的主要功能是参与肿瘤的转移,为了进一步验证其作用,本研究采用RNA干扰抑制高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231中ASAP1的表达时,检测发现与肿瘤生长和转移密切相关的VEGF水平显著降低,进一步证明了ASAP1在肿瘤转移中的作用。

表1　乳腺癌组织中HER2和Ki67及MMP-2 与

HER2：人表皮生长因子受体2；Ki67：增殖细胞相关核抗原；MMP-2：基质金属蛋白酶2； ASAP1：ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1

图2不同转移性乳腺癌细胞中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达

图3ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)基因(左)和蛋白(右)水平检测RNA干扰ASAP1-mRNA对ASAP1表达的影响

综上所述,本研究在乳腺癌组织和细胞水平分别验证了ASAP1与肿瘤的转移和增殖有相关性,提示ASAP1有望成为一类新的乳腺癌的肿瘤标志物和治疗靶点,但值得注意的是HER2与ASAP1的表达却无相关性,这可能与调控HER2表达和功能信号通路的复杂性和多样性有关[9-12],说明病理诊断中联合检测HER2和ASAP1对乳腺癌的诊断、疗效和预后有重要参考价值,HER2在乳腺癌转移中的作用与ASAP1是否存在共同机制尚不清楚,目前的研究发现这两种蛋白参与肿瘤转移均与small GTPases家族相关[13-14],因此深入研究small GTPases在乳腺癌转移中的作用,有可能发现调控HER2与ASAP1的共同靶点,将为乳腺癌的治疗提供新的途径。

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e23359.

Study on the Expression of ASAP1 in Breast Cancers and Its Clinical SignificanceZHANGTinga,LIUWen-junb. (a.DepartmentofLaboratoryMedicine,b.DepartmentofPathology,HankouHospitalofWuhan,Wuhan430012,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of ADP ribosyl-factor GTP enzyme activator protein 1(ASAP1) in breast cancer,and explore the correlation between ASAP1 and breast cancer,in order to find new target in the treatment for breast cancer.MethodsA total of 41 patients with breast cancer admitted in Hankou Hospital from Jun.2010 to Jun.2013 were selected by simple random sampling,the expression levels of proliferating cell nuclear antigen(Ki67),matrix metalloproteinases-2(MMP-2),human epidermal receptor 2(HER2) and ASAP1 in breast cancer were detected by immunohistochemistry method in order to explore the correlation;the expression levels of HER2 and ASAP1 in mammary cancer cells with different invasiveness was detected by Western blot and compared;furthermore,the impact of siRNA on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was investigated，negative siRNA was added into the MDA-MB-231 cell culture system.Resluts Statistical analysss showed that HER2 expression had no correlation with ASAP1(P=0.803),and was significantly associated with Ki67 and MMP-2(P=0.035;P=0.013)；immunobloting assay demostrated that highly invasive breast cancer cells with a high level of ASAP1 and low unes with a weak ASAP1 expression (P<0.01),in contrast,no association between HER2 and ASAP1 was observed (P>0.05);expression of ASAP1 in MDA-MB-231 cells was repressed by siRNA,while expression level of VEGF was significantly lower than the control group(P<0.01).ConclusionExpressionofASAP1inbreastcanceriscorrelatedwiththeproliferationandmetastasisofthecancercells,therefore,ASAP1canbeatherapeutictargetinthetreatmentforbreastcancer.

Keywords：Breastcancer;ADPribosyl-factorGTPenzymeactivatorprotein1；ProliferatingcellnuclearantigenKi67；Matrixmetalloproteinase-2；Humanepidermalreceptor2

收稿日期：2014-04-24修回日期：2014-12-17编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.051

中图分类号：R737.9

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)11-2057-03