鞍山中心医院丙型肝炎病毒亚型的分布状态

张艳红，解 莹，谢 晨，刘文芝，魏 越

(1.大连医科大学附属第二医院 感染疾病科，辽宁 大连116027;2.鞍山市中心医院 传染科，辽宁 鞍山114001)

丙型肝炎病毒(HCV)于1989年首次被分离出来，到目前已经成为全球慢性肝脏疾病的主要原因之一［1］。据WHO 估计［2］，全球HCV 的感染率为3%，估计约1.7 亿人感染，每年新发丙型肝炎约3.5万例。与其他肝炎病毒的预后不同，HCV 感染具有较高的慢性化比例，并与肝硬化和原发性肝癌的发生关系密切。根据HCV 基因的遗传差异性，可将HCV 分为不同的基因型和亚型。根据HCV 基因型可以了解不同基因型和亚型的地理分布，有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案。HCV 基因型与抗病毒治疗和预后密切相关［3-4］。不同的基因对流行病学、疫苗研制、临床抗病毒治疗、预后等方面有着明显影响。本文采用型特异性引物逆转录巢式PCR 法对189 例抗-HCV抗体和HCV RNA 均阳性的患者进行HCV 的基因分型，以了解鞍山地区HCV 流行的基因型分布状态，为今后鞍山地区HCV 疫苗的研制及抗病毒治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 标 本

选取2011年4月至2014年5月期间鞍山市中心医院门诊及住院病例共189 例。所有患者的HCV抗体检测和HCVRNA定量检测均阳性，并且所有患者出生地均在鞍山。所有标本均于患者进行抗病毒治疗前收集，12 h 内分离血清，-70 ℃冰存备用。

1.2 主要仪器设备

PCR 仪5700 -PCR 为美国MJ 公司生产，低温高速离心机日立55P-72 为日本Hitachi 公司生产，电泳仪为北京六一仪器厂生产。

1.3 主要试剂

HCV 抗体检测为北京贝尔公司产品，HCV RNA检测为瑞士罗氏公司产品，RNA 酶抑制剂为普洛麦格(北京)生物技术有限公司产品，Taq DNA 聚合酶为天根生化科技(北京)有限公司产品，限制性内切酶Ⅲ为Biolabs 产品，琼脂糖和相对分子质量标准等购自北京华美生物技术有限公司。

1.4 引物设计合成

引物根据HCV 病毒RNA 的全长序列设计，设计区域选择HCV RNA 5＇ -NCR 区。序列如下:

正向外引物F1:5＇—CTG TGA GGA ACT ACT GTC TT—3＇

反向外引物R1:5＇—AAC ACT ACT CGG CTA GCA GT—3＇

正向内引物F2:5＇—TTC ACG CAG AAA GCG TCT AG—3＇

反向内引物R2:5＇—GTT GAT CCA AGA AAG GAC CC—3＇

1.5 HCV RNA 基因分型检测

1.5.1 血清HCV RNA 提取:1.5 mL 经高压灭菌的离心管，每管加血清100 μL，加入300 μL 的RNA 提取液:异硫氰酸胍(TRIZOL)，室温静置5 min;每管加入80 μL 氯仿，混匀后，室温静置10 min;在12000 r/min、4 ℃下离心15 min，吸取上清180 μL置入高压灭菌的1.5 mL 离心管中，加入异丙醇200 μL;用75 ﹪的乙醇400 μL 洗涤RNA 沉淀1 次;在10000 r/min、4 ℃下离心8 min，弃上清，RNA 沉淀在空气中自然干燥;加入DEPC 水(核酸酶抑制剂)10 μL，70 ℃水浴1 min 后立即冰浴备用。

1.5.2 分型PCR:逆转录巢式PCR 扩增(RTnested-PCR)RT 与第1 轮PCR 反应在同一试管中进行，取模板RNA 10 μL，5 ×缓冲液2 μL，dNTP 3 μL，引物F1 和R1 各0.5 μL，RNasin 0.15 μL，10 ×缓冲液2 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，加ddH2O 补充至20 μL;置5700 型全自动PCR 仪上，逆转录反应条件为42 ℃预变性20 min;依次30 个循环，每次循环条件为93 ℃1 min，50 ℃30 s，72 ℃1.5 min，最后72 ℃延伸5 min，得到外扩增PCR 产物。取5 μL 为模板，进行第2 轮PCR 反应，10 ×缓冲液2 μL，dNTP 2 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，引物F2 和R2 各0.5 μL，加ddH2O 补充至20 μL;置5700 型全自动PCR仪上94 ℃预变性2 min 后，再依次30 个循环，每次循环条件为94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，最后72 ℃延伸7 min，得到内扩增PCR 产物。整个实验过程均设置阳性对照、阴性对照及空白对照。取扩增产物10 μL，加入制备好的含有0.5%溴化乙锭的2.0%琼脂糖加样孔中。于TBE 缓冲液中电泳20 min。然后在紫外线透照器下观察橙红色荧光带。HCV 分型的PCR 产物为49 bp(1a)，144 bp(1b)，174 bp(2a)，123 bp(2b)。

2 结 果

189 份血清标本，单基因型分别检测出了1b 和2a 型，未发现混合型感染，其中11 份为阴性，1b 型95 例(53%)和2a 型83 例(47%)。电泳图见图1。

图1 HCV 基因分型结果(2.0%琼脂糖电泳)Fig 1 HCV genotype result (2.0% agarose electrophoresis)

3 讨 论

根据HCV 基因组的序列同源性，Simmonds等［5］将HCV 分为6 种基因型和31 种亚型。在此分型方法的基础上，目前已报道的基因型有11 个，基因亚型超过70 种［6］。本研究根据Simmonds 基因分型原理，采用型特异性引物逆转录巢式PCR 法对189 例标本进行HCV 的基因分型。型特异性引物逆转录巢式PCR 法简便易操作，但检查一个样本需使用多个引物，费用较高。但是就临床来说，对于HCV 患者的诊治是具有指导意义的，在临床上常只需将1 型和其它基因型区别开来，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量［7-8］。

HCV 基因型地理分布差异的流行病学特征，有助于明确病毒的种系发育和传播途径、有利于抗病毒治疗和疫苗的研制。HCV 病毒分型具有一定的地域性，1 ～3 型呈全球流行，1a 型流行于欧洲、澳洲、南美洲和北美洲［9-12］;1b 和2a 型在亚洲地区分布广泛;2 型也广泛分布于欧美等发达国家，但较1型少见［13］;基因3 型分布于东南亚国家［14］;基因4型主要存在非洲及中东地区，尤其是埃及，超过90%的病例感染［15］;基因5 型和6 型仅在局部地区流行，其中5 型仅在南非地区流行［16］，6 型是越南及其周边地区的主要基因型［17］。中国多见1b 和2a型，以1b 为主［18］。中国南方，1b 型甚至可高达90%［19］;北方地区2a 分布高于南方［20］。本研究检测了189 例HCV 分型结果显示，1b 型95 例，占53%;2a 型83 例，占47%。与以前的报道不一致，可能与便捷的交通，导致其在国内的传播、人口的流动、HCV 基因组变异有关［19，21-22］。近几年一些研究显示，中国北方地区基因型较单一，以1b 和2a 为主［23-24］，南方地区HCV 基因型种类较多，以1b 为主，2a、3a、3b 及6a 型各自占较大比例［25-26］。本次检测HCV 基因分型中，重要为1b 和2a 型，未发现其他基因型，与Chen YD 等［23］和白尚星［24］报道的相一致。由于本组收集的标本数量有限及采用的型特异性引物逆转录巢式PCR 法所选用的HCV 5＇-UTR 区高度保守，不同基因型在该区段的基因差异较小，不足以区分某些基因亚型;北方经济相对落后，研究HCV 基因分型的医疗机构及报道也少。因此不能排除有其他基因型存在的可能。进一步的结果有待与相关流行病调查机构和医院展开科研合作，为HCV 所致肝炎的疾病控制和诊断治疗提供更多的实验依据。

综上，本研究采用了型特异性引物逆转录巢式PCR 法初步研究了鞍山地区的HCV 基因型的分布状态，发现鞍山地区HCV 分型为1b 型和2a 型两种，有必要在临床上推广HCV 基因分型的常规检测，以便更好了解中国北方地区HCV 基因型的分布及变化，为今后疫苗研制策略及抗病毒治疗提供依据。

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