双重PCR检测沙门氏菌和变形杆菌方法的建立

郇 娟，戈红雨，张成龙，韩双羽，师 伟，王玉宝

（1.天津医科大学第二医院感染性疾病研究所，天津300211；2.天津医科大学总医院感染科，天津300052）

论著

双重PCR检测沙门氏菌和变形杆菌方法的建立

郇 娟1，戈红雨2，张成龙1，韩双羽1，师 伟1，王玉宝1

（1.天津医科大学第二医院感染性疾病研究所，天津300211；2.天津医科大学总医院感染科，天津300052）

目的：建立快速鉴定腹泻患者粪便标本中沙门氏菌和变形杆菌的双重聚合酶链式反应（PCR）方法。方法：针对沙门氏菌属特异基因invA和变形杆菌属特异基因tuf分别设计特异性引物，将天津某医院肠道门诊腹泻患者粪便标本经SS培养基分离培养后，对可疑菌株同时进行invA-tuf基因双重PCR鉴定和生化鉴定，比较两种方法结果的一致性；对沙门氏菌进一步行血清学分型。结果：双重PCR和生化反应都各自鉴定得到沙门氏菌31株和变形杆菌62株，而且二者鉴定结果完全一致；31株沙门氏菌包括鼠伤寒、肠炎等常见血清型和格兰扁、菲尔摩雷等罕见血清型，均能扩增出283 bp长度片段，62株变形杆菌包括48株奇异变形杆菌、8株普通变形杆菌、2株潘氏变形杆菌、4株产黏液变形杆菌，均能扩增出541bp长度片段。结论：invA-tuf基因双重PCR方法能够快速可靠地鉴定SS培养基上生长的沙门氏菌和变形杆菌。

沙门氏菌；变形杆菌；双重PCR；生化反应

食源性疾病是全球重要的公共卫生问题之一，对人类的健康危害已引起人们高度关注。自1996-2010年FoodNet数据报告显示沙门氏菌已经成为食源性细菌性致病菌所致死亡的首因[1]。变形杆菌也是导致食源性疾病的常见病原菌之一,其导致的食物中毒数量位居前列[2]。在选择性分离培养沙门氏菌的SS培养基（Salmonella Shigella agar）上，变形杆菌亦可生长，而且菌落颜色、形态与沙门氏菌有相似之处，可致混淆。鉴定沙门氏菌属的多价血清和因子血清能够与少数变形杆菌发生交叉凝集，引起鉴定困难[3]。因此，需要进行繁琐费时的完整生化反应鉴定才能将二者正确区分。invA和tuf分别是沙门氏菌属和变形杆菌属特异基因，本研究尝试建立invA-tuf双重PCR方法，期望能快速可靠地鉴别这两种食源性病原菌。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 研究所用菌株均分离自2013年5月-10月我院肠道门诊腹泻患者粪便标本中。质控菌株大肠杆菌 ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853，为本研究所保存。

1.2 主要仪器 PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）、脉冲场凝胶电泳仪（美国BIO—RAD公司）、GelDoc XR凝胶成像系统（美国BlO－RAD公司）、DYY—6D型电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.3 主要试剂 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）为北京陆桥公司产品，SS琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司产品，API20E生化试剂条和0.85%NaCl为法国梅里埃公司产品，沙门氏菌诊断血清为泰国S&A公司产品。Premix Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准DL-2000、电泳缓冲液均购自大连宝生物Takaba生物工程公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，invA和tuf基因引物序列分别选自参考文献[4-5]，序列分别为：

invA-F CTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATT

invA-R AGTTTCTCCCCCTCTTCATGCGTTACCC

tuf-F AAATTGTTGAATTAGCAGAAGCA

tuf-R GCGATTGGGTGGATCAGTTC

引物扩增的目的基因invA片段长度大小为283 bp，扩增的tuf基因片段长度为541 bp。

1.4 菌株分离与培养 细菌培养分离与生化鉴定严格按《全国临床检验操作规程》（第3版）操作。取适量腹泻患者粪便标本用亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)增菌，37℃增菌16 h后，取增菌培养液一环接种于SS培养基上，37℃培养过夜。

1.5 菌株的鉴定 挑取SS培养基上的中等大小、中心黑色的圆形菌落进行纯培养，将纯培养的菌落同时进行双重PCR和生化鉴定。

1.5.1 双重PCR鉴定 煮沸法提取菌株基因组DNA，反应体系为invA和tuf基因的上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶12μL，模板DNA 1μL，加灭菌去离子水至25μL。反应条件：94℃预变性5 min后，进行如下循环30次：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s；终末延伸5min。反应结束后取5μL 1%琼脂糖凝胶电泳，电压120 V，电泳约30 min，以DNA标志物DL2000为参照，用凝胶成像仪成像观察结果。大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853为阴性质控菌株。随机选取1株沙门氏菌1317和1株变形杆菌1224的扩增产物测序，将序列在GenBank进行同源性比对。

1.5.2 菌株的生化鉴定 挑取纯培养后的单个菌落接种于API20E生化试剂条，于37℃培养20 h后观察结果。

1.6 沙门氏菌的血清学鉴定 沙门氏菌的血清学鉴定步骤按照泰国S&A公司提供的沙门氏菌血清诊断操作步骤进行，依照沙门氏菌抗血清诊断附录和沙门氏菌检验国家标准(GB/T4789.4-2010)，根据测定得到的抗原式确定沙门氏菌的血清型。

2 结果

2.1 双重PCR鉴定结果 可疑菌落进行双重PCR鉴定，有31株菌扩增出283 bp长度的片段，判定为沙门氏菌，随机选取的沙门氏菌1317的扩增产物测序，与 Genbank中 invA基因序列一致性为100%；有62株菌扩增出541 bp长度的片段，判定为变形杆菌，随机选取的变形杆菌1224的扩增产物测序，与Genbank中的tuf基因序列有99%的一致性。部分PCR结果如图1所示。

图1 部分沙门氏菌和变形杆菌双重PCR产物电泳结果Fig 1 Electrophoresis resultsofPCR productsofpartial Salmonella and Proteus

2.2 生化鉴定结果 可疑菌落经生化鉴定，有31株为沙门氏菌，与双重PCR鉴定结果完全一致；有奇异变形杆菌48株、普通变形杆菌8株、潘氏变形杆菌2株、产黏液变形杆菌4株，共计变形杆菌62株，与双重PCR鉴定结果完全一致。

2.3 沙门氏菌血清学鉴定结果 31株沙门氏菌血清分型共涉及5个血清群、11个血清型，具体见表1。

表1 沙门氏菌的血清型分布情况Tab 1 Distribution of serotypesof Salmonella

3 讨论

目前食源性致病菌的检测方法多种多样，既有传统的分离培养法，也有聚合酶链式反应、基因芯片等，各有利弊。例如，传统的分离培养法中，沙门氏菌和变形杆菌在SS培养基上的菌落都可以呈现为圆形、扁薄、半透明，中间黑色，但是如果依靠人为主观区分，可造成误判。个别奇异变形杆菌与沙门氏菌具有共同的抗原，可以与沙门菌属A-F多价血清、因子血清O19发生强凝集反应，增加了菌株鉴定困难。根据沙门氏菌检验国家标准(GB/ T4789.4-2010)，沙门氏菌的生化鉴定操作步骤多，大约需要2～4 d才能完成，并且不能与变形杆菌完全区分开来，故检测沙门氏菌和变形杆菌采用生化鉴定方法时，应使用全套生化反应试剂，因而耗时费力，不利于协助临床及时判断病情。

沙门氏菌invA基因核苷酸序列高度保守，为属特异性基因[6]，编码吸附和侵袭上皮细胞的表面抗原。Rahn等[7]以其为靶基因用PCR方检测沙门氏菌，检出率为97%，所用的引物经过不断的优化，目前检出率可达100%。变形杆菌属tuf基因也具有高保守性[8]，用于检测变形杆菌效果良好[9]。本研究采用了invA-tuf双重PCR方法，经过与生化反应对比，二者鉴定结果完全一致,没有发现PCR结果阴性的标本其生化鉴定结果阳性，而且PCR方法明显节约时间。痢疾杆菌和致病性大肠杆菌等也是重要的食源性致病菌，其在SS培养基上的菌落形态、大小、颜色与沙门氏菌、变形杆菌明显不同，可以从培养基上区分开来，不会对PCR结果造成干扰。

本组沙门氏菌不仅有常见的鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌等血清型，还有格兰扁、菲尔摩雷和奥里塔曼林沙门氏菌等国内罕见报道的血清型，均可以扩增出283 bp的特异条带。而本组变形杆菌包含了奇异、普通、潘氏、产黏液4个菌种，也都能扩增出541 bp的特异条带。这进一步证实了本研究采用的靶基因有很好的敏感性和特异性，invA-tuf双重PCR方法能够快速可靠地区分和鉴定沙门氏菌和变形杆菌，对于尽早指导临床诊断和治疗有很好的帮助。

值得注意的是，极其微量的污染即有可能造成PCR扩增假阳性的产生，因此要有严格的质量控制并且认真遵守操作规程。还有一些报道采用PCR方法对食品或粪便直接检测病原菌，具有快速和灵敏的特点。但是考虑到抗菌药物药敏试验以及基因分型等溯源需求，PCR方法尚不能完全取代传统的培养方法。

（感谢中国疾病预防控制中心腹泻病室对本研究提供的支持和帮助）

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（2014-07-24收稿）

Establishment of double PCRmethod for detection of Salmonella and Proteus

HUAN Juan1，GEHong-yu2，ZHANGCheng-long1，HANShuang-yu1，SHIWei1，WANGYu-bao1
（1.Institute of Infection Disease，The Second Hospital，Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China；2.Department of Infection Disease,GeneralHospital,Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300052，China）

Objective:To develop adouble PCR assay forsimultaneousidentification of Salmonella and Proteus isolated from stoolsamples ofpatientswith diarrhea.Methods:Based on the invA gene in Salmonella and the tuf gene in Proteus,2 pairsofprimerswere designed.The stoolsamplesofdiarrhea patients in the diarrhea outpatientclinic ofa hospital in Tianjin were collected for the culture on the Salmonella Shigella agar after which double PCR and biochemical identification were carried out simultaneously with the suspected colonies.The consistency of the two methods was evaluated.The serological typing was carried out for Salmonella.Results:Thirty-one strains of Salmonella and 62 strains of Proteus were detected by double PCR and biochemical identification respectively,and the results were identical for the twomethods.The 31 strainsof Salmonella included both the common serotypes(e.g.S.Typhimurim and S.Enteritidis）and rare serotypes（e.g.S.Grampian and S.Fillmore）.283 bp and 541 bp fragmentswereobtained forall Salmonella and 62 strainsof Proteus(48 P.mirabilis，8 P.vulgaris，2 P.penneriand 4 P.myxofaciens)，respectively.Conclusion:The invA-tuf double PCR assay couldmake rapid and reliable identification of the Salmonella.spp and Proteus.spp isolated on the Salmonella Shigella agar.

Salmonella；Proteus；double PCR；biochemical tests

R372

A

1006－8147（2015）01-0084-03

天津市卫生局科研基金资助项目（2013KZ112)

郇娟（1988-），女，硕士在读，研究方向：细菌耐药及致病机制；通信作者：王玉宝，E-mail：wyb2046@163.com。