同型半胱氨酸对小鼠成神经瘤细胞毒性作用研究

苟 芸，黄国伟，陈 爽，张绪梅

（天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津300070）

论著

同型半胱氨酸对小鼠成神经瘤细胞毒性作用研究

苟 芸，黄国伟，陈 爽，张绪梅

（天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津300070）

目的：研究同型半胱氨酸（Hcy）对小鼠成神经瘤细胞（N2a）毒性作用并探讨其对pERK1/2蛋白表达的影响。方法：培养的N2a细胞加入不同浓度Hcy，随机分为4组：分别为正常对照组及Hcy低、Hcy中、Hcy高浓度组，根据预实验结果确定以上4组Hcy干预浓度分别为0、30、300和1 000μmol/L。作用72 h后，用酶标仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性，MTT法检测细胞增殖情况，蛋白质免疫印迹法检测N2a细胞pERK1/2蛋白表达水平。结果：与正常对照组相比，Hcy低、中、高浓度组细胞培养液中LDH活性均显著升高，差异具有统计学意义（P值分别为0.013、0.008和0.011，P<0.05）。低、中、高浓度Hcy作用后，MTT检测细胞增殖活力下降，OD值降低，与对照组比较，差异具有统计学意义（P值分别为0.01、0.006和0.009，P<0.05）。各Hcy干预组pERK1/2蛋白表达量降低，且中、高浓度Hcy组pERK1/2蛋白表达量与对照组相比差异具有统计学意义（P值分别为0.038、0.007，P<0.05）。结论：Hcy能抑制磷酸化的ERK1/2蛋白表达，从而对N2a产生毒性作用，进而抑制N2a增殖，提示降低血清中Hcy水平可以对神经细胞产生保护作用。

同型半胱氨酸；小鼠；成神经瘤细胞N2a；细胞凋亡；pERK1/2

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种体内不能自行合成的含硫四碳氨基酸，也是蛋氨酸和半胱氨酸重要的中间代谢产物。流行病学研究显示，血浆中Hcy水平升高是阿尔兹海默症、血管性痴呆、帕金森病和中风等神经退行性疾病的危险因素之一[1-2]。此外，有研究报道，母体内Hcy浓度升高可以导致胎儿神经管畸形[3]。Hcy可增加血脑屏障的通透性导致大脑对Hcy的暴露，发挥其神经毒性作用[4]。有关Hcy如何损伤神经系统，以及引发神经退行性病变的具体机制尚不清楚。目前研究认为，Hcy发挥神经毒性作用的机制较为复杂，可能与N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体过度激活、氧化应激损伤及低甲基化等有关[5-7]。细胞外信号调节激酶（external-signal regulated kinase, ERK）1/2是介导神经细胞损伤的一种重要信号蛋白分子，但目前有关ERK1/2如何介导神经细胞的损伤少有报道。小鼠N2a成神经瘤细胞系是一种来源于脑组织的细胞系，是进行神经系统研究的重要细胞模型。本实验以N2a细胞为受体细胞，研究Hcy是否通过调控pERK蛋白表达发挥其毒性作用。

1 材料与方法

1.1 材料 同型半胱氨酸（H4628）购于Sigma公司；DMEM（#10569）购于Gibco公司；兔抗大鼠多克隆一抗ERK1/2（#4695）、pERK1/2（#4370）购自Cell Signaling公司；BCA蛋白试剂盒（AR1046）购于博士德公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（IH-0011）购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；ECL化学发光底物试剂盒（WBKIS0100）购于Merck Millipore公司；乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（A020-2）购自南京建成生物工程研究所；小鼠成神经瘤细胞N2a（目录号：TCM29）购自中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1 N2a细胞培养 N2a细胞在含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液中贴壁生长。将细胞接种于直径60mm培养皿置于37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞完全贴壁，浓度约为5×106，将其分为4组：正常对照组、Hcy低、Hcy中、Hcy高浓度组，以上4组Hcy干预浓度分别为0、30、300、1 000 μmol/L。作用72 h后收集细胞和培养液进行相关指标的检测。

1.2.2 以LDH试剂盒检测LDH活性 收集72 h各组细胞培养液，按试剂盒说明书操作。于96孔板中分别加入相应的试剂，混匀，室温放置5min，于波长450 nm处用酶标仪测吸光度值。LDH活性（U/L）×标准品浓度×1 000，计算LDH活性。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖活力 将细胞制成悬液，调整细胞密度为1×104/mL，接种于96孔板，每组8个复孔，每孔200μL，同时做空白对照。分别于24、48、72、96 h后每孔加MTT 20μL，继续培养4 h，离心后弃孔内培养上清液，加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解后，用酶标仪于490 nm波长下测光密度（OD）值。

1.2.4 Western blot检测细胞中pERK和ERK蛋白表达 收集细胞后用PBS洗两次，800 r/min离心3 min，弃上清。加150μL裂解液后超声3次（20Hz，每次10 s，间隔10 s）。16 000×g，4℃离心15min，取上清液。细胞中蛋白浓度用BCA蛋白试剂盒检测。将等量蛋白（约30μg）在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转NC膜。将膜分别放在含p-ER K（1∶2 000）和ER K（1∶2 000）的抗体中4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加山羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，用化学发光底物试剂显色。蛋白条带用ImageJ2.0软件进行定量分析。

1.3 统计分析 计数资料结果采用SPSS 13.0统计软件处理数据，多组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，各组间两两比较采用SNK-q检验。数据以±s表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察 光镜下可见，正常N2a细胞贴壁生长，呈圆形或豆状，簇拥成团，边缘光滑，折光性较强，个别细胞有轴突。与对照组相比，各Hcy干预组细胞量减少，单个散在细胞增多；细胞不易“抱团”且出现细胞碎片，Hcy高浓度组尤其明显（图1），提示Hcy可导致N2a细胞明显损伤。

图1 N2a细胞形态学观察（×100）Fig 1 M orphologic observation of N2a cells(×100)

2.2 Hcy对N2a细胞的毒性作用 细胞培养液LDH活性检测发现，低、中、高浓度Hcy干预组的LDH活性均高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。表明Hcy造成细胞损伤，膜通透性增高，且在一定浓度范围内，Hcy的毒性作用呈浓度依赖性。见表1。

表1 不同浓度Hcy对N2a细胞LDH活性的影响（n=3，±s）Tab 1 Theneurotoxicity of Hcy on N2a cells（n=3，±s）

表1 不同浓度Hcy对N2a细胞LDH活性的影响（n=3，±s）Tab 1 Theneurotoxicity of Hcy on N2a cells（n=3，±s）

与正常对照组比较aP<0.05；与Hcy低浓度组比较bP<0.05；与Hcy中浓度组比较cP<0.05

组别 LDH活性/（U／L）正常对照组 23.15±3.18 Hcy低浓度组 29.52±1.82aHcy中浓度组 33.66±3.76abHcy高浓度组 40.50±1.91abc

2.3 Hcy对各组N2a细胞增殖的影响 在干预48、72和96 h后各个时间点，Hcy低、中、高各浓度组的OD值均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。且Hcy浓度越高，OD值越低，说明其抑制N2a增殖的效果越明显，见图2。

与正常对照组比较aP<0.05

2.4 pERK1/2蛋白的表达 Western blot分析各组pERK1/2蛋白的表达发现，中、高浓度Hcy作用组pERK蛋白表达量低于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。另外，与Hcy低浓度组比较，Hcy高浓度组pERK蛋白表达量亦显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 Hcy对pERK 1/2蛋白表达的影响Fig 3 TheHcy effectson thep rotein expression of pERK 1/2

3 讨论

正常人体内血浆中Hcy浓度为5～15μmol/L[8]，遗传因素引起Hcy代谢相关的亚甲基四氢叶酸还原酶、胱硫醚-β-合成酶缺乏或活性降低，或某些营养素缺乏（如叶酸、维生素B6、B12缺乏）均可导致高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinaemia,HHcy）[9]。研究表明高同型半胱氨酸能显著提高在体和离体培养细胞中神经元的兴奋性和氧化损伤[9]。本实验MTT检测结果Hcy干预组OD值小于对照组（P值分别为0.010、0.006和0.009，P＜0.05），说明Hcy可抑制N2a细胞的增殖活力。LDH是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外。本实验通过检测细胞培养液中LDH活性，发现Hcy干预组培养液LDH活性高于对照组（P值分别为0.013、0.008和0.011，P＜0.05），说明Hcy可对N2a细胞膜造成损伤。故光镜下发现Hcy干预组细胞数量少于对照组的原因可能为Hcy抑制N2a增殖使产生子代细胞的数目减少或者是对细胞膜产生损伤进而引起细胞死亡数目增多造成。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase,MAPK）是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用，其家族成员之一ERK1/2在中枢神经系统高度表达，调控神经细胞的生长、增殖与分化，并在神经细胞损伤机制中扮演着重要的角色[10-12]。有研究表明，叶酸缺乏可提高培养神经细胞内Hcy的浓度，且叶酸可通过激活ERK1/2磷酸化促进神经干细胞增殖[13-15]。本研究结果表明，Hcy干预可减少ERK1/2磷酸化水平抑制神经细胞增殖。鉴于机体内叶酸可作为Hcy代谢的辅助因子，促进Hcy合成甲硫氨酸，进而降低Hcy水平[17]，同时，流行病学研究和临床调查发现，脑梗死等中枢神经系统疾病患者血清中的叶酸值明显低于其他病人，而长期补充叶酸、维生素B6、B12等B族维生素可有效降低Hcy水平，促进脑损伤患者神经系统的生长、修复和恢复，并认为这种作用可能与叶酸影响神经细胞的增殖、分化与凋亡有关[18]。故我们推测Hcy浓度的改变可能介导叶酸对神经细胞增殖作用，叶酸可能通过降低Hcy浓度在神经系统发育及维持中起保护作用。本实验将为叶酸及Hcy在神经系统疾病发生发展过程中作用机制的研究奠定基础。

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（2014-07-30收稿）

Neurotoxicity ofhomocysteineonmouse N2a neuroblastoma cells

GOUYun，HUANGGuo－wei，CHENShuang，ZHANGXu－mei
（DepartmentofNutrition and Food Hygiene，SchoolofPublic Health，Tianjin MedicalUniversity，Tianjin 300070，China）

Objective：Toexplore theneurotoxicityofhomocysteine（Hcy）onmouseneuroblastoma cells（N2a）and itseffecton pERK1/2 protein level．Methods：Cultured N2a cellswere divided into fourgroups according to the concentrations ofhomocysteine：controlgroup（Hcy 0μmol/L），low－Hcy（30μmol/L），moderate－Hcy（300μmol/L），high－Hcy（1 000μmol/L）groups．After72 h Hcy treatment，the toxicity ofN2a cellswasdetected by LDH（lacate dehydrogenase）assay kit，cellproliferation abilitywas detected by MTTmethods，and the protein expression of pERK1/2 was detected by western blot．Results：The LDH activity in Hcy－treated groupswas increased compared with control group（P＜0．05）．The cells proliferation ability was decreased after Hcy treatment，and OD valueswere reduced comparedwith controlgroup（P＜0．05）．Theprotein expression ofpERK1/2 decreased afterHcy treatment，and significantdifferencesamong themoderate，high Hcydosegroupsand controlgroupwere found（P＜0．05）．Conclusion：The toxiceffectofHcyon N2a cellsmaybe caused by reduced ERK1/2 protein phosphorylation expression．Itsuggests thata low serum Hcy levelmay havea protectiveeffecton neuralcells．

homocysteine；mouse；neuroblastoma cell；cellapoptosis；pERK1/2

R15

A

1006－8147（2015）01-0006-03

国家自然科学基金资助项目（81373003）；中国博士后科学基金资助项目（2014M550148)

苟芸（1990-），女，硕士在读，研究方向：营养与神经退行性疾病；通信作者：张绪梅，E-m ail:zhangxumei@tijm u.edu.cn。