Nanog及其假基因Nanog P8在肿瘤中的研究进展

孙秀梅，张 飞 综述，牛瑞芳 审校

（天津医科大学肿瘤医院公共实验室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津 300060）

综述

Nanog及其假基因Nanog P8在肿瘤中的研究进展

孙秀梅，张 飞 综述，牛瑞芳 审校

（天津医科大学肿瘤医院公共实验室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津 300060）

Nanog；Nanog P8；肿瘤

随着肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)学说的提出，干细胞相关基因在肿瘤发生中的作用日益被重视。Nanog是一种维持干细胞全能性的核转录因子，与包含POU结构域的Oct4（o ctamer-binding transcription factor 4）和包含HMG盒的Sox2（sex determining region Y-box 2，SRY-box 2）共同维持胚胎干细胞的自我更新和多潜能性，被认为是胚胎干细胞的标志物之一[1]。最初的研究认为Nanog在胚胎干细胞中表达，在分化的细胞和正常组织中不表达,然而最近的研究发现Nanog在很多肿瘤细胞及组织中存在表达，并且证实这些肿瘤细胞及组织中的Nanog主要来自其假基因Nanog P8的转录产物[2]。本文针对Nanog P8和胚胎Nanog在基因定位、结构和蛋白序列的区别以及二者在肿瘤中发挥的作用进行简要总结。

1 Nanog P8与胚胎Nanog的区别与联系

除了胚胎Nanog基因外，目前发现人Nanog还有11个假基因（Nanog P1－11），这11个假基因主要存在于大多数的肿瘤细胞系和组织中，正常的细胞中则不存在[3]。由于这些假基因中存在大量的突变或缺失，在这些假基因当中，只有Nanog P8的转录产物没有内部终止密码子，具有完整的开放阅读框（open reading frame，ORF），能够翻译为完整的、具有功能性的Nanog蛋白[4]。

1.1 Nanog P8与胚胎Nanog基因的定位 胚胎Nanog基因定位于染色体12p13.31，由4个外显子和3个内含子构成[5]。与胚胎Nanog不同，假基因Nanog P8位于15q14，仅含有1个外显子[6]。尽管二者的结构不同，但两个基因的蛋白质编码区却有99.5%的一致性。运用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，Blast）进行基因序列比对，结果发现两者间仅有5个碱基不同（表1）。

表1 Nanog P8与胚胎Nanog基因及蛋白序列比对结果

1.2 Nanog P8与胚胎Nanog的蛋白结构 胚胎Nanog与Nanog P8的ORF均编码305个氨基酸，Blast蛋白序列比对，结果发现两者间仅有3个氨基酸不同（表1）。故商用Nanog的抗体也能识别Nanog P8[7]。因此，两基因转录产物统称为Nanog[6,8]。Nanog蛋白包括N-末端（aa，1-94）、与DNA结合的同源结构域H区（aa，95-154）、C-末端（aa，155-305）3个结构域。而C-末端结构域又进一步被分为C1结构域（aa，155-195）、色氨酸富集的区域W结构域（aa，196-240）以及C2结构域（aa，241-305）3部分[5,9]。其中，N末端结构域具有转录抑制的作用，且受磷酸化或其它的转录后修饰的调节，H区结构域能够与其他DNA或者蛋白结合，从而调控下游基因的转录，C末端结构域具有转录激活的作用[5]。Nanog同源结构域中包含一个核定位序列（nuclear localizatlon sequence，NLS）对于其发挥转录因子的功能具有重要的作用，而对于NLS起关键作用的是同源结构域H中的6个氨基酸（136YKQVKT141），尤其是其中的2个赖氨酸（K137和K140）[5]。由于Nanog P8中构成NLS的氨基酸没有突变，故Nanog P8也定位于核，也具有DNA的识别位点，表明它可能像胚胎Nanog一样，也具有转录因子的功能。

1.3 Nanog P8与胚胎Nanog的鉴别 除了基因的定位、结构不同之外，还可根据以下3点将二者区别开来：（1）在胚胎Nanog的3′非编码区（untranslated regions，UTR）有一个22 bp的碱基序列[6，10]；（2）存在SmaΙ酶切位点[11]；（3）由于在编码区的碱基改变G-A使Nanog P8有Alw N1酶切位点[12]。此外，胚胎Nanog在ESCs中的转录调控已经被深入研究，与Oct4、Sox2协同调控下游基因的表达，Oct4或Sox2的表达下调会影响胚胎Nanog的表达[13]。但是在结直肠癌细胞系中，干扰Oct4和（或）So x2的表达，却对Nanog P8的表达调控不起作用[13]。而且Nanog P8的5′UTR从-1 000 bp到转录起始点却没有Oct4和Sox2的结合位点。因此，推测NanogP8的转录调控与胚胎Nanog的不同[14]。

1.4 Nanog P8与胚胎Nanog功能上的联系 目前研究发现Nanog主要在胚胎干细胞中表达，而Nanog P8主要表达在肿瘤细胞或者组织中，但是由于这两个基因在编码区只有5个碱基的不同，在氨基酸序列上的差异则只有3个，而且这种差异还不在核心区，因此，目前对这两个基因功能上的差异并不十分清晰[13]。多项研究发现，肿瘤细胞中高表达Nanog P8以后能够明显促进细胞的集落形成能力和致瘤能力，而下调Nanog P8后的肿瘤细胞在NOD/SCID小鼠中的成瘤能力明显下降（形成肿瘤的数量和大小减少），表明Nanog P8与癌细胞中的干性有关[15]；此外，在另外一项针对人或小鼠成纤维细胞的研究中发现，Nanog P8和Nanog一样能够诱导多能干细胞的活性。因此，这些结果表明Nanog P8与Nanog在功能上具有极大的相似性。

2 Nanog P8与胚胎Nanog和肿瘤的关系

最初的研究认为Nanog只在胚胎干细胞以及胚胎生殖（e mbryonic germ，EG）细胞等多能性干细胞中表达，在成体组织中不表达。然而最近的研究发现在一些癌细胞（精原细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、人胎儿生殖母细胞、睾丸原位癌和生殖细胞肿瘤等）中也有Nanog的表达[13，16-18]。鉴于肿瘤细胞与胚胎干细胞均有无限增殖及保持低分化状态的特征，尽管肿瘤中Nanog的表达量比在ESCs中低，但仍可推测Nanog可能在肿瘤发生发展中也发挥重要的作用。随后的进一步研究发现，肿瘤细胞中的Nanog主要来自其假基因Nanog P8的转录产物[19]，所以可以推测之前关于Nanog在肿瘤方面的研究大部分为Nanog P8在发挥作用。由于胚胎Nanog和Nanog P8在蛋白的序列、结构上区分不大，而且功能上的差异目前还不清楚，目前的研究中往往将二者的转录和翻译产物统称为Nanog，故以下对Nanog和Nanog P8在肿瘤的研究中的作用统一用Nanog表示。

2.1 Nanog与细胞增殖和细胞周期的关系 多项研究发现Nanog能够影响肿瘤细胞的增殖能力和成瘤能力，如Nanog高表达能够增强肺腺癌细胞的克隆形成能力和集落形成能力，而敲除Nanog后能够抑制肺腺癌细胞的克隆形成能力和增殖能力[20]；此外，另外一项研究也发现，下调乳腺癌细胞中的Nanog的表达后，乳腺癌细胞的增殖能力和克隆形成能力显著下降[21]。机制方面的研究发现利用小RNA干扰技术下调胚胎癌细胞中的Nanog表达后，多个细胞周期相关蛋白，如CyclinD1、D2、D3、E1以及细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）和细胞周期蛋白依赖性激酶 6（cyclin-dependentkinase 6，CDK6）的表达也下调，表明Nanog可能调控细胞周期相关蛋白的表达[22]。与此相一致的是，有研究发现Nanog表达下调会抑制乳腺癌细胞的增殖和CyclinD1和C-myc的表达，同时导致细胞周期阻滞在G0/G1期。此外，进一步通过染色质免疫沉淀发现Nanog蛋白能够直接与CyclinD1的启动子区相结合从而调控其转录活性，进而调控其表达，从而促进细胞的增殖[21]。

2.2 Nanog与癌细胞的转移和侵袭的关系 多项研究发现虽然Nanog在乳腺癌、卵巢癌和结直肠癌中高表达与患者年龄、性别无关，但是与肿瘤的TNM分期及低生存率有关[12,20-21,23-24]，还与血管和胆管受侵程度有关[23]，这些结果提示Nanog可能在肿瘤的进展中起关键性的作用[25]，Nanog的高表达可作为浆液性卵巢癌，结直肠癌和乳腺癌等预后不良的标志[15,26-27]。随后分子机制的研究发现，在卵巢癌细胞系中，下调Nanog的表达会导致E-Cadherin、FOXO1、FOXO3a、FoxJ1及FOXB1的mRNA水平增加，而Nanog表达上调会使其表达减少[25]。此外，还有研究发现Nanog与Oct4的共表达或Nanog单独存在的情况下，会通过转录调控引起Slug表达水平升高导致细胞的运动能力和肿瘤的转移能力增强[20]。由于E-cadherin和Slug在癌细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中发挥重要作用，因此这些结果表明Nanog可能通过调控癌细胞EMT从而促进癌细胞的迁移和侵袭。

2.3 Nanog与CSC的关系 过去几年的大量研究已经为CSC在实体肿瘤中的存在及特征提供了强有力的证据[6,28]。CSC在无血清培养基中能够形成悬浮的微球（集落），有研究发现，采用慢病毒介导的shRNA技术，抑制结肠癌细胞中Nanog的表达以后，会明显减少结肠癌细胞的集落形成率。而且这种现象在前列腺癌、神经胶质瘤中也进一步得到证实[6,29]。肿瘤干细胞中往往呈现为CD133+或CD44+，而多项研究发现高表达CSC标志物的癌细胞Nanog的表达水平也高，例如CD133+或CD44+的癌细胞的Nanog表达水平明显高于CD133-或CD144-的癌细胞。此外，有证据显示，Nanog能够诱导癌细胞中CD133和乙醛脱氢酶1（a ldehyde dehydrogenase class1，ALDH1）的表达上调[30-32]。总之，这些结果说明Nanog的表达上调与肿瘤干细胞的发生密切相关。

2.4 Nanog与肿瘤细胞耐药的关系 目前已有文献报道，CSC的耐药特性与干性标志物Nanog和Oct4的表达有关。在人食管癌中，Nanog高表达会增强细胞对顺铂的耐药能力[28]；在肺腺癌中，Nanog与Oct4的高表达会增强P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）mRNA的表达水平，从而导致癌细胞对顺铂耐药[20]；此外，在口腔鳞癌细胞中也观察到类似现象[33]。机制方面的研究表明，Nanog促进肿瘤细胞耐药可能与其信号转导及转录激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在核内形成复合物从而导致STAT3特异性的转录激活以及上调多药耐药蛋白ABCB1基因（编码P-gp）的表达有关[34-35]。

2.5 Nanog与肿瘤细胞免疫耐受的关系 肿瘤细胞能够适应机体的免疫系统从而逃脱CD8+的T细胞所介导的细胞杀伤和凋亡[36-37]。Noh等发现Nanog表达水平上调能够使肿瘤细胞处于免疫抵抗状态，使肿瘤细胞对具有杀伤性的细胞毒性T细胞耐受；采用小RNA干扰技术下调Nanog的表达之后，肿瘤细胞失去免疫耐受表型，能够被细胞毒性T细胞识别[37]。因此，Nanog可以作为免疫治疗的一个潜在的靶点。

3 肿瘤细胞中调控Nanog的信号传导通路

目前的研究发现多条在肿瘤细胞中激活的信号通路均与Nanog的表达有关，例如在肺癌、乳腺癌和胶质瘤细胞中，表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）信号通路的激活能够上调Nanog的蛋白和mRNA水平，从而促进了肿瘤细胞的干性[38-39]。此外，还有研究发现，在肺腺癌细胞中，胰岛素样生长因子-1的受体（insulin-like growth factors-1 receptor，IGF-1R）激活以后通过PI3K/Akt/GSK 3/β-catenin信号通路导致Nanog的转录激活；而抑制IGF-1R会导致Nanog表达下降[40]。在结直肠癌细胞中，有研究发现黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）能够通过与Nanog结合从而使其发生磷酸化而激活，更有意思的是，激活的Nanog能够直接结合到FAK的启动子上，从而增强FAK的转录，形成一个正反馈，进而介导肿瘤细胞的侵袭等一系列生物学行为[41]。

4 展望

越来越多的研究表明，Nanog及其假基因Nanog P8在多种肿瘤细胞或组织中表达，而且通过增强癌细胞的干性从而促进了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为，大量证据显示肿瘤组织中Nanog高表达与患者预后不良密切相关，因此，干预Nanog或者Nanog P8的表达有可能成为一种有效的治疗肿瘤的新手段。但是目前对肿瘤细胞中调控Nanog或Nanog P8表达的分子机制方面的研究很少；而且对Nanog表达出现以后通过何种方式促进了肿瘤的发生发展还知之甚少；此外，目前的研究推测Nang蛋白可能存在多个翻译后修饰的氨基酸位点，而对调控这些位点修饰的上游通路的研究目前也才刚刚开始。因此，相信随着研究的深入，我们必将进一步深入理解Nanog的调控机制以及Nanog促进肿瘤发生发展的分子机制，而这些研究也将有助于我们更好地理解肿瘤细胞的生物学行为以及为研究新的肿瘤治疗手段提供新的思路和方法。

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（2014-07-10收稿）

R730.2

A

1006－8147（2015）01-0090-04

国家自然科学基金资助项目（81372844；81071731）

孙秀梅（1985-），女，硕士在读，研究方向：生物化学与分子生物学；通信作者：牛瑞芳，E-mail:niuruifang@tjmuch.com。