溶血磷脂酸预处理提高心肌梗死区移植干细胞存活的实验研究

侯剑峰，刘学彬，丛祥凤，胡盛寿，陈 曦

·基础研究·

溶血磷脂酸预处理提高心肌梗死区移植干细胞存活的实验研究

侯剑峰，刘学彬，丛祥凤，胡盛寿，陈 曦

目的探讨溶血磷脂酸（LPA）预处理对心肌梗死后间充质干细胞（MSCs）移植早期存活率的影响。方法MSCs取自雄性SD大鼠，缺氧无血清条件下LPA预处理MSCs，ELISA法测定培养液中血管内皮生长因子（VEGF）含量。冠状动脉结扎法制作雄性SD大鼠心肌梗死（MI）模型。3周后，经超声筛选合格MI大鼠随机分为3组：① 培养基（DMEM）注射组：心肌梗死区细胞培养基注射（n＝24）；②MSCs组：心肌梗死区雄性MSCs注射（n＝26）；③L－MSCs组（n＝27）：心肌梗死区LPA预处理的雄性MSCs注射组，细胞注射量为2×106。Real time－PCR技术检测SRY基因（Y染色体），TUNEL的方法评价移植细胞凋亡，免疫组化检测毛细血管密度，超声心动图评价心功能。结果LPA预处理显著提高了缺氧无血清条件下MSCs的VEGF分泌；与单独MSC移植相比，LPA预处理显著提高了移植MSCs存活率［1 h：（50．93±11．43）%vs．（23．63±2．24）%，P＝0．28；1 d：（34．96±12．1）%vs．（14．75±1）%，P＝0．31；1周：（1．38±0．35）%vs．（0．69±0．14）%，P＝0．44］；减少了移植MSCs凋亡，同时促进了局部毛细血管的新生，但没有获得心功能的显著改善。结论LPA预处理能够提高移植MSCs存活，增强其旁分泌作用，促进血管的发生，是一种有效地提高MSCs移植存活的策略。

溶血磷脂酸；干细胞移植；存活；凋亡；心肌梗死；大鼠

1 资料与方法

1．1 实验动物与方法 实验动物为SPF级Sprague－Dawley（SD）大鼠，均由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，6～8周龄，体重260～280 g。MSCs取自雄性SD大鼠，缺氧无血清条件下LPA预处理第3代MSCs，移植前4＇，6－二脒基－2－苯基吲哚盐酸（4’，6－diamidino－2’－phe－nylindole，DAPI）标记。采用冠状动脉结扎法建立心肌梗死模型；3周后，使用超声心动图筛选大鼠心肌梗死模型（左心室短轴缩短率＜30%，左心室射血分数＜60%）将存活大鼠90只随机分为三组，每组30只完成第二次手术［2］：①培养基（DMEM）注射组：心肌梗死区细胞培养基注射30 μl（n＝24）；②MSCs组：心肌梗死区雄性MSCs单点注射（n＝26），细胞注射量为2×106／只；③L－MSCs组（n＝27）：心肌梗死区LPA预处理的雄性MSCs单点注射，细胞注射量为2×106／只。

1．2 观察指标 ELISA法测定培养液中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量。移植后1 h、1 d、1周，Real－time PCR定量Y染色体基因（sex determining region on Y，SRY）评价细胞存活，SRY基因的引物序列为：上游引物：5’－CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA－3’，下游引物：5’－ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC－3’［2］；移植后1天采用脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌组织中移植后MSCs凋亡情况；移植后1周，免疫组化检测血小板／内皮细胞黏附分子－1（platelet／endothelial cell adhesion molecule－1，PECAM－1）（CD31）评价毛细血管密度，超声心动图评价心脏功能。

1．3 统计学分析 应用SPSS 13．0软件包进行统计学分析，计量数据采用均数±标准差（s）表示，α＝0．05为显著性检验水准。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量 Hypoxia／SD条件下随着培养时间的延长，各组培养液上清中VEGF含量随时间延长呈增加趋势，LPA（10 μM）处理的L－MSCs组培养液上清中VEGF的含量在各个检测时间点（1 h，3 h，6 h，12 h）均显著高于单纯培养的DMEM组，具体结果如表1所示。

表1 不同时间点培养液上清中VEGF含量（n＝30，s）

表1 不同时间点培养液上清中VEGF含量（n＝30，s）

注：与对照组比较*P＜0．05

组别 1 h 3 h 6 h 12 h DMEM组（ng／L） 31．3±2．5 47±2．6 67．3±4．7 109．6±3．5 L－MSCs组（ng／L） 35±3．1*61±3．6*84．7±3．1*148．3±7．1*

图1 Real－time PCR定量分析MSCs移植后存活率

2．2 Real－Time PCR定量SRY基因 所有细胞和心肌组织提取的DNA质量完好，OD260／OD280比值均在1．7～1．9之间。在DMEM组中没有检测到SRY基因。如图1所示：SRY基因扩增曲线平行性好，每次扩增曲线之间相差3．3个Ct值左右，根据Ct值和雄性MSCs细胞数之间建立的标准曲线，标准曲线方程为：Y＝－3．51x＋16．91；相关系数R2＝0．9992。通过SRY基因标准曲线建立的方程计算存活细胞数，细胞移植1 h，L－MSCs组存活细胞比例约为最初移植总数的（50．93±11．43）%，其大约为MSCs组存活细胞数目的两倍（23．63±2．24）%，（P＝0．011），移植后1 d和1周，L－MSCs组存活的MSCs比例1 d：（34．96±12．1）% vs．（14．75±1）%（P＝0．037）；1周：（1．38±0．35）%vs．（0．69±0．14）%（P＝0．042），均高于MSCs组。

2．3 细胞凋亡 细胞移植后1 d，组织冰冻切片经荧光显微镜镜检在移植区域内可以发现如图2所示：移植的MSCs由于DAPI标记而发出蓝色荧光，在DMEM组中未见标记细胞，TUNEL阳性的细胞发出黄绿色荧光。细胞移植后1 d，L－MSCs组TUNEL阳性的凋亡细胞的比例明显低于MSCs组（6±2）% vs．（16±3．61）%（P＝0．024）。

图2 TUNEL法检测细胞移植后1 d两组MSCs凋亡发生率

2．4 新生毛细血管密度 如图3所示，细胞移植后1周，DMEM组、MSCs组、L－MSCs组心肌缺血区的毛细血管密度分别为（16．33±2．52）个／0．2 mm2、（25．0 ±3．61）个／0．2 mm2和（31．33±3．06）个／0．2 mm2，MSCs组新生毛细血管密度显著高于 DMEM组（P＝0．034），这种显著提高的局部毛细血管新生现象在L－MSCs组被强化（vs．DMEM组，P＝0．008；vs．MSCs组，P＝0．044）。

2．5 心功能评价 细胞移植后1周对各个实验组进行超声心动图检测评价心功能。如表2所示，LMSCs组的左室射血分数和左室短轴缩短率高于MSCs移植组和DMEM注射组；L－MSCs组左心室收缩末径和左心室舒张末径较其他两组也获得了改善的趋势，但是，以上数值的改善均未获得统计学意义。

表2 三组超声心动图左心室功能指标比较（n＝30，?s）

3 讨 论

本研究旨在心肌梗死动物模型中探究LPA预处理对移植MSCs存活的影响，主要发现有：①在缺氧无血清条件下，LPA能够促进MSC分泌VEGF；②LPA预处理在MSCs移植到缺血心肌后不同的时间点（1 h，1 d，1周）明显增强了移植细胞存活；③ 移植LPA预处理的MSCs在移植后1周促进了血管的新生。

研究发现心肌梗死区细胞移植后，由于缺血、失巢凋亡以及炎症反应等因素，大部分细胞在移植后数天之内发生死亡，限制了MSCs的治疗作用［3］。Muller－Ehmsen等人用Real－time PCR的方法对移植后供体细胞的存活情况作了研究，结果发现在大鼠慢性缺血性心肌病模型中移植的MSCs在移植后1 h左右时，存活率为（25．8±15）%，移植2 d后，存活率为（27．6±8．3）%，而移植5 d后，存活率仅存（4．6±3．9）%［4］。在本研究中，MSCs移植1 h后，Real－time PCR方法检测到（23．63±2．24）%的细胞存活；移植1 d和1周后，分别还有（14．75±1）%和（0．69±0．14）%的细胞存活；进一步研究发现，LPA预处理显著提高了移植MSCs的存活，约为单纯移植MSCs存活的2倍左右。

在本细胞实验中发现LPA通过能够拮抗Hypoxia／SD条件诱导的凋亡作用促进细胞存活［1］。已有研究表明，移植到心肌梗死区的供体细胞的凋亡高峰在移植后1 d左右，而在1周之后很少再有细胞凋亡的发生［5］。因此，本研究选择了移植后1 d作为检测时间点，TUNEL检测比较移植到缺血心肌的MSCs的凋亡情况发现：MSCs移植1 d后，大约一半的移植细胞由于凋亡而丢失，这一结果与Nakamura等人的研究结果相似［6］；而LPA预处理后，这种凋亡现象的发生明显少于MSCs组，结合本实验的Real－time PCR数据，可以初步推断LPA预处理在体内对MSCs也产生了抗凋亡作用进而促进了移植细胞的存活。

MSCs移植后的旁分泌效应，特别是促进局部血管新生作用是其改善梗死后心脏功能的重要机制之一［7］。在本研究发现LPA预处理的MSCs在缺氧无血清处理后，能够分泌比单纯缺氧无血清处理更多的VEGF；同时，在心肌梗死边带区，LPA预处理组移植的MSCs获得了更多的新生毛细血管。笔者分析主要原因是由于更多存活的MSCs能够释放更多的细胞因子和血管活性因子［8］。但是，与既往研究结果不同［9］，在本实验中并未获得与MSCs移植有关的心功能改善，分析其原因，认为选择了1周作为心功能评价时间点，移植的MSCs很难在短暂的时间内迅速发挥其疗效；此外，本研究为减少细胞移植后经针道的细胞丢失选择单点注射，在单个点内能够移植的细胞数量有限，也会影响移植疗效。

总之，本研究初步证实：LPA预处理能够显著提高移植MSCs的存活率，促进了移植区毛细血管密度的增加。迅速有效地提高心梗区LPA含量或者使用LPA类似功能的药物将会是一种新的有效地抗移植MSCs凋亡的治疗策略，其对临床提供了重要的理论依据。

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Preconditioning by lysophosphatidic acid enhancing early survival of implanted mesenchymal stem cells following myocardial infarction

Hou Jian－feng，Liu Xue－bin，Cong Xiang－feng，Hu Sheng－shou，Chen Xi
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，Fuwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing，100037，China

Chen Xi，Email：chenxifw＠aliyun．com．cn

ObjectiveTo evaluate the effects of lysophosphatidic acid（LPA）preconditioning on early survival of implanted mesenchymal stem cell（MSCs）in rat models of myocardial infarction（MI）．MethodsMale SD rat MSCs were prepared and subjected to hypoxia and serum deprivation．The secretion of vascular endothelial growth factor（VEGF）from MSCs were evaluated by ELISA．MI model was induced by left coronary artery ligation in female SD rats．Three weeks later，the qualified animals were allocated randomly to 3 groups，1．DMEM group：to receive intramyocardial injection with 30 μl DMEM，2．MSCs group：to receive intramyocardial injection with 2×106male rat MSCs，and 3．L－MSCs group：to receive intramyocardial injection with 2×106LPA－preconditioning male MSCs．Cell survival was assayed with quantitative real－time polymerase chain reaction to identify Y chromosome gene and apoptosis was assayed with TUNEL staining．Capillary density was estimated by the immunohistochemistry．The echocardiogram（UCG）was used to evaluate the heart function．ResultsLPA（10 μM）enhanced VEGF release from MSCs under hypoxia／SD in vitro．Compared with MSCs group and DMEM group，although there was no difference in the improved heart function，LPA preconditioning significantly enhanced early cell survival rate by nearly 2－fold（1 hour：50．93±11．43%vs．23．63±2．24%，P＝0．28；1 day：34．96±12．1%vs．14．75 ±1%，P＝0．31；1 week：1．38±0．35%vs．0．69±0．14%，P＝0．44），and decreased the apoptotic percentage of implanted MSCs in infarcted myocardium thus increased the number of newly formed capillaries．ConclusionLPA preconditioning could be a novel approach for cell transplantation to enhance the early cell survival and the therapeutic potential．

Lysophosphatidic acid；Stem cell transplantation；Survival；Apoptosis；Myocardial infarction；Rat细胞移植已成为心肌梗死治疗的新策略，但是移植后干细胞存活率低下极大限制了该策略的疗效。在前期细胞研究中笔者发现：溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）预处理能够拮抗缺氧无血清（hypoxia and serum deprivation，hypoxia／SD）诱导的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）凋亡［1］。本研究旨在活体动物水平观察LPA预处理对心肌梗后MSCs移植早期存活率的影响并对初步探讨可能机制。

2014-10-23）

2014-11-15）

10．13498／j．cnki．chin．j．ecc．2015．01．17

北京市科技新星计划（Z111107054511080）；北京市优秀人才培养计划（2013D009008000004）；协和青年科研基金项目（2013XHQN03）

100037北京市，中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心阜外心血管病医院心血管疾病国家重点实验室

陈曦，Email：chenxifw＠aliyun．com．cn