阴离子交换高效液相色谱法测定3-硝基邻苯二甲酸中杂质4-硝基邻苯二甲酸、邻苯二甲酸的含量

姚枝玉，吴秋娟，董 静，李 薇，张 斐江苏省食品药品监督检验研究院，南京 0008；江苏先声药业有限公司，南京 004

阴离子交换高效液相色谱法测定3-硝基邻苯二甲酸中杂质4-硝基邻苯二甲酸、邻苯二甲酸的含量

姚枝玉1，吴秋娟2，董 静2，李 薇2，张 斐2
1江苏省食品药品监督检验研究院，南京 210008；2江苏先声药业有限公司，南京 210042

目的：采用阴离子交换高效液相色谱法对3-硝基邻苯二甲酸及其杂质4-硝基邻苯二甲酸、邻苯二甲酸进行色谱分离，并测定杂质4-硝基邻苯二甲酸、邻苯二甲酸的含量。方法：SIELC Primesep D（4.6 mm×50 mm，5 μm）色谱柱；流动相：0.01%H2SO4水溶液-乙腈，梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃；进样量：5 μL；检测波长：222 nm、226 nm、262 nm。采用杂质外标法对3-硝基邻苯二甲酸样品中4-硝基邻苯二甲酸、邻苯二甲酸进行定量。结果：3种物质在0.5 μg·mL-1~20 μg·mL-1范围内线性关系良好 （r>0.9995），检测限分别为0.03 μg·mL-1、0.1 μg· mL-1、0.05 μg·mL-1。结论：该方法快速简便，灵敏度高，重现性好，可用于两杂质的定量分析。

阴离子交换；3-硝基邻苯二甲酸；4-硝基邻苯二甲酸；邻苯二甲酸

3-硝基邻苯二甲酸 （3-Nitrophthalic acid，3-NPA）和4-硝基邻苯二甲酸4-Nitrophthalic acid，4-NPA）是重要的有机合成中间体，可用于合成医药、染料、感光材料、农作物保护剂等[1]，它们的制备通常先由邻苯二甲酸（O-phthalic acid，O-PA）通过硝化反应生成两种硝基衍生物的混合物，再经过分离得到[2]。在3-硝基邻苯二甲酸中通常残留有未分离完全的4-硝基邻苯二甲酸、邻苯二甲酸。因此实现对三者的分离和准确定量有非常重要的意义。

3-硝基邻苯二甲酸、4-硝基邻苯二甲酸和邻苯二甲酸均为疏水性较强的酸性物质，在中性流动相中易解离，导致以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱中保留较弱而不能被分离[3]。文献报道，三者的分离主要是采用离子抑制色谱法，在流动相中加入酸作为离子抑制剂，使溶质以分子形式与固定相作用，从而实现分离[4]。该方法需要严格控制pH，条件苛刻且运行时间较长。本文采用阴离子交换高效液相色谱法，可快速、准确地测定3-硝基邻苯二甲酸中杂质4-硝基邻苯二甲酸和邻苯二甲酸的含量，且有效缩短了分析时间，操作简便，结果准确可靠。

1 仪器与试药、试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（DAD），MiliQ去离子水发生器（美国Millipore公司）。

3-硝基邻苯二甲酸 （安耐吉化学有限公司，批号SH0124、SH0328、SH0423）；4-硝基邻苯二甲酸对照品（SIGMA-ALORICH，纯度≥97.0%）；邻苯二甲酸对照品（SIGMA-ALORICH，纯度≥99.5%）。

乙腈（TEDIA,HPLC）；硫酸（南京化学试剂有限公司，AR）；纯水（Milli-Q纯水仪）。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 供试品溶液 精密称量3-NPA 20 mg至20 mL量瓶中，加溶剂[0.01%H2SO4水溶液-乙腈=65∶35]适量，超声10 min使溶解，放冷至室温，定容，即为供试品溶液。

2.1.2 1%自身对照溶液 精密量取供试品溶液1 mL至100 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，即为1%自身对照溶液。

2.1.3 杂质对照品溶液 取杂质4-NPA、O-PA对照品各约10 mg，精密称定，至同一20 mL量瓶中，加溶剂适量，超声10 min使溶解，放冷至室温，定容；精密量取1 mL至100 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，即为对照品溶液，平行2份。

2.1.4 系统适用性溶液 取3-NPA，杂质4-NPA、O-PA对照品各适量，加溶剂，超声处理使溶解，并定量稀释制成每1 mL中约含3-NPA 1 mg、4-NPA 10 μg和O-PA 10 μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。

2.2 色谱条件

SIELC Primesep D（4.6 mm×50 mm，5 μm）阴离子色谱柱；流动相：A-乙腈；B-0.01%H2SO4水溶液（精密量取硫酸0.1 mL置1000 mL水中，混匀即得），梯度洗脱（梯度程序见表1）；流速：1.0 mL· min-1；柱温:30℃；紫外检测器吸收波长：222、226、262 nm；进样量：5 μL。在上述色谱条件中3-NPA的最大吸收波长为222 nm，4-NPA的最大吸收波长为262 nm，O-PA的最大吸收波长为226 nm。分别在262 nm和226 nm波长处按杂质外标法计算杂质4-NPA及O-PA的含量，在222 nm波长处按主成分自身对照法计算其他杂质的含量。在上述条件下，邻苯二甲酸、3-硝基邻苯二甲酸和4-硝基邻苯二甲酸的保留时间分别为1.48、1.96和4.18 min。系统适用性典型图谱和3-NPA及其杂质4-NPA、ONPA色谱图见图1～5。结果显示：各成分之间分离度符合要求。

表1 梯度洗脱程序

图1 系统适用性典型图谱

图2 供试品溶液色谱图

2.3 方法学研究与验证

2.3.1 线性相关性 分别精密称取3-NPA，杂质4-NPA、O-PA对照品各适量，用溶剂配制成浓度分别为0.5、1、3、5、10、20 μg·mL-1的杂质对照品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图。以浓度C（μg· mL-1）对峰面积A进行线性回归，得到3-NPA、4-NPA、O-PA分别在222、262、226 nm波长下的线性回归方程和相关系数分别为A1=22.8292C+1.0581（r2=1.0000）；A2=11.5783C+0.0679（r2=1.0000）；A3= 12.8816C-0.0359（r2=1.0000）。结果表明三者在0.5～20 μg·mL-1（相当于供试品溶液主成分浓度的0.05%～2%）浓度范围内线性关系良好。

图31 %自身对照溶液色谱图

图4 杂质4-NPA对照品溶液色谱图

图5 杂质O-NPA对照品溶液色谱图

2.3.2 检测限与定量限 取对照品适量，加溶剂配制成一定浓度的对照品溶液，按倍比稀释法稀释，以信噪比（S/N）3∶1时相应的浓度确定检测限；以信噪比（S/N）为10∶1时相应的浓度确定定量限。见表2。

表2 3-NPA、4-NPA、O-PA的检测限及定量限

2.3.3 溶液稳定性试验 取“2.1”项下供试品溶液、1%主成分自身对照溶液、杂质对照品溶液于室温下不避光放置，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，考察溶液稳定性。杂质对照品溶液中O-PA和4-NPA测定结果的RSD分别为0.80%、0.57%，供试品溶液中杂质O-PA均未检出，杂质4-NPA及总杂检出量的RSD分别为2.9%、1.9%。表明均在12 h内稳定。

2.3.4 重复性及中间精密度试验 按“2.1”项下平行配制6份供试品溶液及其1%主成分自身对照溶液，平行制备2份杂质对照品溶液，进样测定，考察方法重复性。结果表明，6份供试品中O-PA均未检出，4-NPA及总杂的检出量平均值分别为0.19%、0.33%，RSD分别为4.0%、4.3%，重复性好。变动不同仪器、不同时间、不同人员作中间精密度试验，测得杂质的量均一致，表明方法重现性良好。

2.3.5 进样精密度试验 取“2.1.1”项下供试品溶液5 μL注入高效液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。3-NPA峰面积平均值为19789.3，RSD为0.08%，说明进样精密度良好。

2.3.6 回收率试验 分别精密移取低、中、高不同体积的杂质对照品溶液与供试品混合，配制为回收率试验低、中、高浓度的供试品溶液（各3份），其中O-PA和4-NPA的浓度分别为供试品3-NPA浓度（1 mg·mL-1）的0.2%、0.5%和0.8%。按“2.2 色谱条件”测定，每份溶液重复测定2次，计算回收率，验证方法的准确性，结果见表3。

表3 O-PA与4-NPA的回收率试验（n=9）

结果表明，低、中、高3水平的回收率良好，OPA的平均回收率为102.1%（RSD=0.58%，n=9），4-NPA的平均回收率为102.8%（RSD=1.0%，n=9）。

2.3.7 耐用性试验 分别考察柱温变化±5℃、流速相对值变化±10%以及梯度时间变化±1 min测定时、仪器色谱行为变化。取供试品溶液、1%主成分自身对照溶液和杂质对照品溶液，分别进样分析，按杂质外标法计算4-NPA、O-PA含量，按1%自身对照法计算未知杂质含量。结果表明，各条件下各组分的峰均可达到基线分离，杂质含量的绝对值之差在±0.05%以内，方法耐用性好。

2.3.8 样品杂质测定 按“2.1”方法配制各溶液。取供试品（批号：SH0124、SH0328和SH0423）溶液、杂质对照品溶液、1%自身对照溶液及系统适用性溶液各5 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表4。

表4 杂质测定结果

结果表明，三批供试品中O-PA均未检出，4-NPA均小于0.5%，总杂质（包括O-PA、4-NPA和未知杂质）量均小于1%。

3 讨 论

3.1 色谱柱选择

SIELC Primesep D阴离子交换色谱柱为键合碱性离子对官能团和烷基长链的反相分析柱，其分离原理结合了疏水特性和离子交换双重作用，对本文提到的这种酸性较强的物质混合物具有非常好的分离作用。邻苯二甲酸、3-硝基邻苯二甲酸和4-硝基邻苯二甲酸在该色谱柱上保留较强，峰型好，杂质分离情况好，因此选用SIELC Primesep D阴离子交换色谱柱（4.6 mm×50 mm，5 μm）。同时，该色谱柱的使用需要与酸性较强的流动相联用，因此首先将流动相锁定为乙腈-0.1%H2SO4水溶液。

3.2 流动相选择

本实验中首先试用乙腈-0.1%H2SO4（50∶50）为流动相，结果3-NPA与O-PA无法分离 （见图6-A）。降低流动相中乙腈的比例，保留时间变长，分离效果变好（见图6-B）。调整乙腈-0.1%H2SO4比例至15∶85时二者达到基线分离，但4-NPA出峰位置有未知杂质干扰，且基线波动大，峰拖尾（见图6-C）。在各种梯度条件下，分离效果都不理想。

有机酸的保留主要受酸解离程度以及在固定相上离子交换能力的影响[5]。邻苯二甲酸、3-硝基邻苯二甲酸和4-硝基邻苯二甲酸按酸性大小排列：邻苯二甲酸<3-硝基邻苯二甲酸<4-硝基邻苯二甲酸。SIELC Primesep D色谱柱上键合了碱性离子对官能团，降低流动相中硫酸溶液的比例，则硫酸根离子减少，有机酸竞争色谱柱上的碱性离子对官能团的竞争力增强，保留时间增大；同时减少流动相中乙腈的比例，洗脱能力减小，保留时间增大，均有利于化合物分离。综合考虑，将H2SO4溶液的浓度调整为0.01%，分离度得到明显改善。当乙腈-0.01% H2SO4水溶液的比例为35∶65时方法可用，等度条件下即可实现三者分离。调整梯度，使供试品中其他杂质均洗脱。经过试验最后梯度条件确定为表1所得程序，进样结果如图6-D。三种有机酸的分离度好，峰形对称，分析速度较快，线性关系和精密度良好。

图6 流动相选择图谱

3.3 溶剂选择

3-NPA、4-NPA及O-PA在流动相中溶解度均较好，且性质稳定；以流动相为溶剂对杂质测定无干扰，因此选择流动相（0.01%H2SO4水溶液-乙腈= 65∶35）为溶剂。

目前文献中有关3-硝基邻苯二甲酸、4-硝基邻苯二甲酸、邻苯二甲酸的同时分离的研究很少，同时其作为阴离子交换高效液相色谱法应用的案例具有典型的特点。因此，本方法的建立较有意义。

[1] 崔小明.间苯二甲酸的生产、应用及市场前景[J].精细石油化工进展，2000，1（5）：44245.

[2] 董立文.间苯二甲酸国内生产分析 [J].辽宁化工，2005，34（2）：78280.

[3] 赵景婵，郭治安，常建华，等.有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件研究 [J].色谱，2001，19（3）：260-3.

[4] 练鸿振，王惟汉，李丹妮.3-硝基或4-硝基邻苯二甲酸及其杂质的高效液相色谱分析法：中国，200410065981.4[P].2005-06-29.http://dbpub.cnki.net/ Grid2008/Dbpub/Brief.aspx?ID=SCPD&subBase=all

[5] Fischer K,Bipp HP,Bieniek D,et al.Determination of monomeric sugar and carboxylic acids with ion-exclusion chromatography[J].J Chromatogr A,1995,706(1-2): 361-73.

Determination of 4-Nitrophthalic Acid and O-Phthalic Acid in 3-Nitrophthalic Acid by Anion Exchange High Performance Liquid Chromatography

YAO Zhi-yu1,WU Qiu-juan2,DONG Jing2,LI Wei2,ZHANG Fei2
1Jiangsu Institute for Food and Drug Control,Nanjing 210008,China;2Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co., Ltd,Nanjing 210042,China

Objective:To establish a method to determine 4-nitrophthalic acid(4-NPA)and O-phthalic acid (O-PA)in 3-nitrophthalic acid (3-NPA)by anion exchange high performance liquid chromatography.Methods:A SIELC Primesep D column (4.6 mm×50 mm,5 μm)was used.The mobile phase consisted of 0.01%H2SO4solution and acetonitrile with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1with the column temperature at 30℃.The injection volume was 5 μL.UV detection wavelength was set at 262 nm, 226 nm and 222 nm.The contents of O-PA and 4-NPA in samples were determined quantitatively by an external standard method.Results:The three substances in the scope of 0.5 μg·mL-1～20 μg·mL-1have good linear relations (r＞0.9995),the detection limit of 3-NPA,4-NPA and O-PA separately was 0.03 μg· mL-1,0.1 μg·mL-1and 0.05 μg·mL-1.Conclusion:The method is simple,accurate and suitable for the determination of 4-NPA and O-PA in 3-NPA.

Anion-exchange;3-Nitrophthalic acid;4-Nitrophthalic acid;O-Phthalic acid

R927.2

A

1673-7806（2015）01-030-04

姚枝玉，女，主管药师 E-mail:cpuyao@sohu.com

2014-07-11

2014-10-31