红景天苷对脂多糖诱导的小鼠心肌损伤保护作用的研究*

朱凌鹏，常厦云，何 贺，高 瑾，颜天华

中国药科大学生理教研室，南京 210009

红景天苷对脂多糖诱导的小鼠心肌损伤保护作用的研究*

朱凌鹏，常厦云，何 贺，高 瑾，颜天华**

中国药科大学生理教研室，南京 210009

目的：研究红景天苷对脂多糖诱导的小鼠心肌损伤的保护作用及其机制。方法：选取雄性Balb/c小鼠50只，随机分为对照组、模型组、地塞米松组、红景天苷低、高剂量组。地塞米松和红景天苷高、低剂量连续灌胃7 d，每天1次，最后一次灌胃后1 h，除对照组外，其余各组腹腔注射LPS，12 h后处死，取血和心脏。结果：红景天苷组小鼠心肌病理改变明显减轻于模型组；相比于模型组，红景天苷组能减少血清中TNF-α、IL-6的含量；减少心肌组织中TLR4、MyD88和NF-资Bp65蛋白的表达。结论：红景天苷减轻脂多糖诱导的小鼠心肌损伤，其机制可能通过调节TLR4/MyD88/NF-资Bp65信号通路，抑制炎症反应。

脂多糖；脓毒症；炎症

脓毒症指由感染引起的全身炎症反应综合征，是各种损伤、创（烧）伤、休克、外科大手术后常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能不全综合征（MODS），是危重患者死亡的重要原因之一。心肌损伤是脓毒症常见并发症之一，文献报道，其损害可引起严重心律失常，心功能不全，心源性休克，并加重全身其它组织器官的缺血缺氧损害[1]。红景天为景天科景天属Rhodiola L.多年生草本植物。红景天苷（Salidroside，Sal）是红景天的主要成分之一，近年来的研究结果表明，红景天苷具有保护心脑血管系统、调节免疫系统、防辐射、抗衰老、抗疲劳和抗肿瘤等多种药理作用[2-4]。然而，红景天苷能否减轻内毒素引起的心肌损伤尚不清楚。有研究表明，内毒素可能通过细胞因子和自由基的作用引起心肌损伤和功能障碍[5]。脂多糖（LPS）通过Toll样受体4（TLR-4）激活核因子-资B（NF-资B），诱导心肌细胞合成肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、一氧化氮（NO）等，进而引起心肌的损伤[6]。本实验主要从炎症方面来研究红景天苷对脂多糖诱导的小鼠心肌损伤的保护作用及其机制。

1 实验材料

1.1 仪器

680型酶联免疫检测仪 （上海众生声明科学发展有限公司）；TU-1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 药品与试剂

红景天苷（由第二军医大学提供，纯度＞99%）；LPS （Sigma-Aldrich， St.Louis，MO，USA，0111：B4）；地塞米松（Dex，浙江仙琚制药股份有限公司，120731）；TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒（DAKEWE，DKW12-3720-096，DKW12-2060-096）。

1.3 动物

50只雄性Balb/c小鼠（20～22 g）：购于扬州大学比较医学中心（SCXK（苏）201X-0001），并取得相应的合格证。

2 实验方法

2.1 分组与给药

选取雄性小鼠50只，随机分为5组，每组10只：对照组、模型组、地塞米松组（Dex，2 mg·kg-1）、红景天苷低、高剂量组（40 mg·kg-1、80 mg·kg-1）。给药组连续灌胃7 d，每天1次，最后一次灌胃1 h后，除对照组外，其余各组腹腔注射LPS（15 mg·kg-1，ip），12 h后处死，取血和心脏。

2.2 心肌组织学观察

腹腔注射LPS后12 h，处死小鼠，取出心脏于4%的甲醛溶液中固定，标本于蜡制模具中切片后进行HE染色，对心肌进行病理组织学检查。

2.3 生化指标测定

腹腔注射LPS后12 h，小鼠经眼眶采血，3500 r·min-1，离心15 min后取上清液于-80℃保存备用，测定血清中TNF-α和IL-6的含量。具体方法见相关试剂盒说明书。

2.4 Western blot测定相关蛋白含量

腹腔注射LPS后12 h，处死小鼠，取出心脏，加入细胞蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂提取各组细胞总蛋白。采用BCA法测定各组细胞总蛋白浓度。蛋白经过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后转移至PVDF膜上。5%BSA溶液中室温封闭膜1 h，TBST洗膜。加入 TLR4、MyD88、NF-资Bp65、GAPDH抗体 （Santa Cruz公司），4℃过夜，TBST洗膜。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级抗体，室温孵育膜1 h。TBST洗膜6次，每次5 min。X光胶片曝光显影。用quantity one软件计算条带灰度值，以显示其蛋白表达量。

2.5 统计学方法所有数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 17.0统计软件，ANOVA分析法进行统计学检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 红景天苷对LPS诱导的小鼠心肌组织结构和超微结构的改变

红景天苷组、地塞米松组与对照组比较，小鼠心肌组织结构未见明显差别。模型组小鼠心肌组织水肿，肌原纤维肿胀、排列稀疏，炎症细胞浸润、纤维变性坏死，肌浆中有少量水泡；红景天苷组心肌的病变明显轻于模型组（见图1）。

3.2 红景天苷对LPS诱导的小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影响

与对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α和IL-6含量显著升高（P<0.01）；而与模型组相比，红景天苷高、低组，地塞米松组小鼠血清中TNF-α和IL-6含量显著降低（P<0.05，P<0.01）（见表1）。显示其心肌保护作用可能与其抑制炎症过程有关。

图1 红景天苷对LPS诱导的小鼠心肌组织病理的影响

表1 红景天苷对LPS诱导的小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影响（±s，n=10）

表1 红景天苷对LPS诱导的小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影响（±s，n=10）

注：与对照组比较：##P<0.01；与模型组比较：**P<0.01，*P<0.05

组别剂量（mg·kg-1）TNF-α（pg·mL-1）IL-6（pg·mL-1）对照组-30.2±4.2 7.3±1.1模型组-112.3±15.6##23.4±3.2##地塞米松组2 52.3±9.1**11.8±1.7**红景天苷组40 92.5±11.8*19.2±2.4*80 79.6±8.6**15.9±1.8**

3.3 红景天苷对LPS诱导的小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-kBp65蛋白的影响

与对照组相比，模型组小鼠心肌中 TLR4、MyD88和NF-资Bp65蛋白含量显著升高 （P<0.01）；而与模型组相比，红景天苷高、低组，地塞米松组小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-资Bp65蛋白含量显著降低（P<0.05，P<0.01），见图2。显示其心肌保护作用可能与调节TLR4/MyD88/NF-资Bp65信号通路有关，进而抑制炎症反应。

4 讨 论

脓毒症是一个相当复杂的病理生理过程，是危重症患者最常见的并发症之一。目前对脓毒症诱导的心肌损伤的可能机制为：细胞因子对心肌的损伤；缺血－再灌注和氧自由基损伤；心肌细胞内Ca2＋超载；能量代谢异常等。

脓毒症时可产生多种细胞因子，它们可直接或通过其他方式对心肌造成损伤。其中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）已被证明是脓毒症发展过程中的中心介质[7]。本研究结果显示，红景天苷能显著降低LPS诱导的小鼠血清中TNF-α和IL-6含量；HE染色结果说明红景天苷能减轻LPS诱导的病理损伤，表明红景天苷能够防治内毒素性心肌损伤。TLR4/MyD88/NF-资Bp65信号通路与炎症反应有关，有研究显示，内毒素小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-资Bp65蛋白含量显著升高，说明减少内毒素小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-资Bp65蛋白表达对小鼠心肌具有保护作用[8]。本实验用quantity one软件计算蛋白条带灰度值，显示蛋白表达含量，红景天苷能降低LPS小鼠心肌中TLR4、MyD88和NF-资Bp65蛋白的含量，显示其心肌保护作用可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-资Bp65信号通路，进而抑制炎症反应。

综上所述，红景天苷对脓毒症小鼠的心脏损伤具有较好的保护作用，其机制可能是通过抑制TLR4/MyD88/NF-资Bp65信号通路来抑制炎症反应。

图2 红景天苷对LPS诱导的小鼠心肌组织中TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白含量的影响

[1] Merx MW,Weber C.Sepsis and the heart[J].Circulation,2007,116(7):793-802.

[2] 李 剑，范维琥，敖 红，等.中药红景天对大鼠缺血心肌Flt21、KDR及Tie22表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2005，25（5）：445-8.

[3]LIANG Xiao-Qing,XIE Pei,ZHANG Yong,et al.Effects of salidroside on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J].CJNM,2010,8(2):127-131.

[4] 滕静如，熊佳鹏，肖 诚，等.红景天的现代药理学研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2006，12（4）：319.

[5] Karima R,Matsumoto S,Higashi H,et al.The molecular pathogenesis of endotoxic shock and organ failure [J].Mol Med Today,1999,5(3):123-32.

[6] Georg B,Pascal K,Naoki N,et al.In vivo expression of pro-inflammatory mediator in the adult heart after endotoxin administration:The role of Toll-like receptor-4[J].J Infect Dis,2001,183(11):1617-25.

[7] Feng Y,Zou L,Zhang M,et al.MyD88 and Trif signalinglaydistinct rolesin cardiacdysfunction and mortality duringendotoxin shock and polymicrobial sepsis[J].Anesthesiology,2011,115(3):555-67.

[8] Boyd JH,Mathur S,Wang Y,et al.Toll-likereceptor stimulation in cardiomyocytes decreases contractility and initiatesan NF-kappaB dependentinflammatoryresponse[J].Cardiovasc Res,2006,72(3):384-93.

The Protective Effect of Salidroside(Sal)on Lipopolysaccharide(LPS)-induced Myocardium Injury in Mice*

ZHU Ling-peng,CHANG Xia-yun,HE He,GAO Jin,YAN Tian-hua**
Department of Physiology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:The aim of the study was to investigate the effect and mechanism of Salidroside (Sal)onlipopolysaccharide(LPS)-induced myocardium injury in mice.Methods:Fifty male Balb/c mice were divided into five groups(n=10):(1)control,(2)model:LPS,(3)positive:dexamethasone(Dex)+LPS,(4)and (5)treatment:high and low dose Sal+LPS.Dex and Sal were administered intragastrically once daily for 7 days.At the 7th day,LPS was injected intraperitoneally 1 h after drug administration.All the mice were sacrificed 12 h after LPS injection,and then the blood and hearts were collected.Results:Compared with the model group,cardiac pathologic changes of the Sal groups were significantly lighter.Dex and Sal significantly attenuated the serum levels of IL-6 and TNF-α;decreased TLR4,MyD88 and NF-资Bp65 protein expression in hearts.Conclusion:Salidroside could alleviate LPS-induced myocardial injury in mice;the anti-inflammatory effect might work through the TLR4/MyD88/NF-资Bp65 signaling pathway.

Lipopolysaccharide;Sepsis;Inflammation

R965.1

A

1673-7806（2015）01-013-03

十二五重大新药创制项目（2011ZX09102-002-01）

朱凌鹏，男，硕士生，研究方向：心血管药理学E-mail:zlp_7882@sina.com

* *通讯作者颜天华，男，副教授，硕士生导师，研究方向：心血管药理学 E-mail:13016931191@126.com

2014-07-12

2014-08-30