奥硝唑对映体对小鼠中枢抑制作用的机制探究*

魏婷婷，孙继红，韩璐薇，王志强，季 晖**

1中国药科大学药理教研室，南京 210009；2南京圣和药业股份有限公司，南京 210038

奥硝唑对映体对小鼠中枢抑制作用的机制探究*

魏婷婷1，孙继红1，韩璐薇2，王志强2，季 晖1**

1中国药科大学药理教研室，南京 210009；2南京圣和药业股份有限公司，南京 210038

目的：探讨右奥硝唑中枢抑制效应与脑内γ-氨基丁酸（gamma amino butyric acid，GABA）系统的关系。方法：经不同剂量右/左奥硝唑处理后使用N，N-二甲基二吖啶硝酸盐（1-（Ethoxycarbonylmethyl）-6-methoxyquinolinium bromide，MQAE）荧光探针检测原代培养小鼠皮层神经元氯离子浓度，并通过western blot方法检测GABAA受体亚基的表达。尾静脉注射给予右/左奥硝唑后测定小鼠高架十字迷宫行为。结果：右奥硝唑剂量依赖性激活小鼠皮层神经元的氯离子通道，经右奥硝唑处理后的皮层神经元能增加GABAA受体α1亚基的水平，且右奥硝唑有潜在的抗焦虑活性。结论：右/左奥硝唑中枢作用不同，右奥硝唑较强的中枢抑制作用可能与激活GABA系统有关。

右/左奥硝唑；氯离子通道；GABA系统

奥硝唑为第3代硝基咪唑类衍生物，具有良好的抗厌氧菌、抗滴虫和抗阿米巴原虫作用，临床上主要用于手术前预防感染和手术后抗敏感厌氧菌。但临床应用时会有肝损伤、肠胃不适、呕吐、头晕、嗜睡等消化系统和神经系统不良反应[1]。前期研究发现，在药效学作用无显著性差别、药代动力学特征相似的前提下，右奥硝唑对小鼠的中枢抑制作用显著强于左奥硝唑[2]，且右奥硝唑的中枢作用能够在一定程度上被GABAA受体拮抗剂所阻断。

γ-氨基丁酸 （gamma amino butyric acid，GABA）为中枢神经系统内主要的抑制性递质。动物及人体内的GABAA受体系五聚体大分子，由5个亚单位组成，分子的中心部位形成门控氯离子通道。每一亚单位包含1个大的细胞外N末端区、3个紧密排列的穿透胞膜的部分（M1-M3）、胞浆区（M4）及一短的胞外C末端[3]。当GABA与其受体结合时，氯离子通道开放，氯离子进入细胞，导致胞内负电位增加，细胞由极化变为超极化，表现出镇静、抗焦虑等中枢抑制作用。

本研究采用 N，N-二甲基二吖啶硝酸盐（MQAE）荧光探针，检测奥硝唑对映体对原代培养小鼠皮层神经元氯离子通道的影响，并通过western blot方法检测给药后GABAA受体α1亚基的表达。最后采用经典高架十字迷宫实验 （elevated plus maze，EPM）对奥硝唑对映体的抗焦虑作用进行探究，从整体动物水平佐证右奥硝唑对GABAA受体的作用。其目的为进一步揭示奥硝唑对映体产生中枢抑制作用差异的作用机制及对临床安全用药提供指导。

1 仪器与材料

1.1 仪器CO2恒温培养箱（Thermo Electron）；倒置显微镜 （OLYMPUS）；多功能酶联免疫荧光检测仪（SpectraMax M3型，Molecular Device）；日立CF16RⅫ高速冷冻离心机；SDS-PAGE电泳仪（Bio-RAD）；eBlot蛋白转移系统 （Genscript）；凝胶成像系统（Bio-RAD，美国）；彩色CCD（Bio-RAD）；自制小鼠高架十字迷宫测试仪[4]。

1.2 试剂与药品

左奥硝唑（批号：20130904，纯度99.8%）、右奥硝唑（批号：20130506，纯度：99.7%），均由南京圣和药业股份有限公司提供，溶媒为含15%丙二醇的生理盐水注射液；γ-氨基丁酸、N，N-二甲基二吖啶硝酸盐（MQAE）、木瓜蛋白酶、DNA酶、GABAAα1、βactin抗体均购于sigma公司；B27、DMEM培养基、胎牛血清均购于Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型，江苏碧云天生物技术研究所）；蛋白裂解液 （Millipore，美国）；蛋白酶抑制剂混合片（Roche）；其他试剂均为市售分析纯。

1.3 动物

ICR种小鼠，体重18～22 g由扬州大学比较医学中心提供，动物合格证号：SCXK（苏）2012-0004。

2 实验方法

2.1 原代培养小鼠皮层神经元

孕18天的ICR小鼠脱颈椎处死，无菌条件下取出胎鼠，迅速分离前额叶皮层，置于预冷的10% FBS DMEM培养液中，去除脑膜。将组织移入新鲜培养液并剪碎，加入木瓜蛋白酶及DNA酶后，置于37℃、5%CO2培养箱中消化30 min。消化过的组织块1000 r·min-1离心5 min后，加入适量的10%胎牛血清DMEM培养液，调整细胞密度至2.5×105个/ mL，接种于预先包被多聚赖氨酸的培养板中，放置于37℃、5%CO2培养箱中培养。4 h后更换为含2%B27的Neurobasal培养液，每48 h更换新鲜的Neurobasal培养液。

2.2 奥硝唑对映体对原代培养皮层神经元氯离子通道激活作用的测定[5]

移除原有培养基，无氯缓冲液 （20 mmol·L-1HEPES，2.4mmol·L-1K2HPO4，0.6 mmol·L-1KH2PO4，1 mmol·L-1MgSO4，1 mmol·L-1CaSO4，130 mmol·L-1NaNO3，10 mmol·L-1glucose）洗涤细胞3次后，每孔加入100 μL，使细胞在含有5 mmol·L-1MQAE的Neurobasal培养液中避光37℃孵育40 min。温热高氯缓冲液（130 mmol·L-1NaCl取代130 mmol·L-1NaNO3，其它成分同无氯缓冲液）洗涤细胞3次后，用SpectraMax M3荧光酶标仪，在激发波长360 nm和发射波长450 nm的条件下测量基础荧光值F0。细胞分别经过0.2、2、20 μM右/左奥硝唑、100 μM GABA、高氯缓冲液处理后再次在激发波长360 nm和发射波长450 nm的条件下测量荧光值F。以测定时间点（trace time/second）为横坐标、相对荧光值（relative fluorescence，F/F0）为纵坐标，作图并进行统计学分析。

2.3 western blot检测

分别用终浓度0.2、2、20 μM的右/左奥硝唑和10 μM地西泮处理细胞，48 h后离心收集细胞。每孔细胞加入适量的蛋白裂解液（Millipore，美国），冰上裂解10 min后收集细胞碎片及裂解液，12000 r· min-1、4℃离心10 min，取上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白定量后在12%SDS-PAGE电泳条件下分离，转染至NC膜（Millipore，美国），用5%BSA于室温下摇床封闭膜2 h。膜在抗GABAA受体α1（1∶500 sigma）和抗β-actin抗体 （1∶4000 sigma）稀释液中4℃孵育过夜，1×T-BST洗膜5 min，共4次后，在二抗稀释液（α1为抗兔，β-actin为抗鼠，稀释比例均为1∶2000，sigma）中室温孵育1 h。再次洗膜后加入发光液反应3 min，置于凝胶成像系统曝光。

2.4 小鼠高架十字迷宫试验（EPM）

64只雄性ICR小鼠随机分为右奥硝唑组（10、20、40 mg·kg-1）、左奥硝唑组（10、20、40 mg·kg-1）、阴性对照组（含15%丙二醇的生理盐水注射液）、阳性对照组（地西泮，2 mg·kg-1），每组8只，雌雄各半。给药10 min后，小鼠置于高架十字迷宫中央平台，使其头部正对其中一个开放臂，释放后即开始记录5 min内下述指标[6]：（1）进入开放臂次数（open arm entry，OE）；（2）开放臂滞留时间 （open arm time，OT），单位为s；（3）进入封闭臂次数（close arm en try，CE）；（4）封闭臂滞留时间（close arm time，CT），单位为s。开放臂和封闭臂总的进入次数（OE+CE）反映小鼠的运动能力，开放臂滞留时间占总测定时间的百分比反映小鼠焦虑状态。

2.5 统计学分析

3 结 果

3.1 奥硝唑对映体对原代培养小鼠皮层神经元氯离子通道的激活作用

如图1所示，与阴性对照高氯缓冲液组相比，100 μM GABA能够显著降低氯离子荧光强度 （P＜0.01）。右奥硝唑呈剂量依赖性地增加原代培养小鼠皮层神经元氯离子通道开放，使胞外氯离子内流，与细胞内MQAE结合从而导致其荧光淬灭，荧光值F降低，F/F0值下降。实验结果提示，右奥硝唑可以显著开放原代皮层神经元上氯离子通道。而左旋奥硝唑增加原代皮层神经元氯离子通道开放的能力明显较弱，与阴性对照组相比，仅随剂量升高有增加胞外氯离子内流的趋势，但所设三个剂量组与阴性对照组相比均无统计学意义（P>0.05）。

图1 奥硝唑对映体对原代培养小鼠皮层神经元氯离子通道的影响（n=6）

3.2 奥硝唑对映体对原代培养小鼠皮层神经元GABAA受体α1亚基表达的影响

经地西泮和高剂量右奥硝唑处理后，原代培养小鼠皮层神经元的GABAA受体α1亚基上调，而左奥硝唑各剂量组均不能增加α1亚基的表达。见图2。

图2 奥硝唑对映体对原代培养小鼠皮层神经元GABAA受体α1亚基表达的影响（n=3）

3.3 奥硝唑对映体对小鼠高架十字迷宫行为的影响

小鼠静脉给药10 min后进行高架十字迷宫行为学实验（见图3），与阴性对照组比较，地西泮组、右奥硝唑高剂量组开臂滞留时间百分比均显著高于对照组（P<0.01或P<0.05）。右奥硝唑中、低剂量组及左奥硝唑各剂量组间开臂滞留时间百分比则差异无统计学意义（P>0.05）。与阴性对照组比较，地西泮组和右/左奥硝唑各剂量组开放臂和封闭臂总的进入次数（OE+CE）差异均无统计学意义（数据未显示）。

图3 奥硝唑对映体给药10 min后对小鼠开臂滞留时间百分比的影响（n=8）

4 讨 论

GABAA受体是配体门控离子通道超家族成员之一，由5个亚基组成五边形异质多肽寡聚体，中心部位形成门控氯离子通道。哺乳类动物大脑中突触型GABAA受体主要是由α、β和γ亚基组成。神经药理学的研究表明，GABAA受体含有GABA识别位点、地西泮识别位点和巴比妥识别位点等。配体能通过直接开放氯离子通道或增加氯离子通道开放频率、时间等途径增加胞内氯离子浓度，使细胞超极化而产生抑制作用。原代培养小鼠皮层神经元培养7天后表达功能性GABAA受体[7]，可用于评价药物是否会引起胞内氯离子浓度改变。N，N-二甲基二吖啶硝酸盐（MQAE）荧光探针以溴离子为配对阴离子，最大激发波长约为360 nm，最大发射波长约为450 nm[8]。MQAE是使用最广泛的一种新型氯离子荧光探针。MQAE以氯离子为配对阴离子，当氯离子浓度升高时，MQAE的荧光强度随着氯离子浓度的增加而成比例地减少。

本研究结果显示，GABA能显著开放氯离子通道，在该测定条件下使荧光强度大幅度下降，右奥硝唑也可降低荧光强度，且呈一定的剂量依赖性，左奥硝唑各剂量组均无明显影响。因此，右奥硝唑中枢抑制作用的产生可能与激活GABAA受体、开放氯离子通道有关。应用western blot进一步研究表明，右奥硝唑和地西泮都能增加原代小鼠皮层神经元GABAA受体α1亚基的表达，因此，右奥硝唑可能作用于GABAA受体而抑制神经元兴奋，最后产生镇静、抗焦虑等中枢抑制效应。

高架十字迷宫是抗焦虑研究中应用最广泛的模型之一，反映的是动物趋近-规避冲突的结果，与焦虑程度直接相关[9]。抗焦虑药可增加动物对开放臂的探索，使开臂滞留时间百分比上升。GABAA受体激动剂为临床抗焦虑药物的经典靶点之一，由此可以推断，若右奥硝唑能够激动GABAA受体，开放氯离子通道，则应该具有一定程度的抗焦虑作用。高架十字迷宫试验结果表明，地西泮和高剂量右奥硝唑能显著增加小鼠开臂滞留时间百分比，而左奥硝唑各剂量组均对小鼠高架十字迷宫各指标均无明显影响。由于试验设计所用各给药剂量组均不影响小鼠开放臂和封闭臂总的进入次数，因此，该结果可以在一定程度上说明高剂量右奥硝唑可以产生抗焦虑作用，其机制可能与GABAA受体有关。

综上所述，右奥硝唑能开放原代培养小鼠皮层神经元氯离子通道，增加GABAA受体α1亚基的表达，并在小鼠高架十字迷宫试验中表现出抗焦虑活性；而左奥硝唑对氯离子通道、α1亚基及小鼠高架十字迷宫表现则无明显影响；推测奥硝唑对映体对中枢神经系统的作用存在差异可能与其对GABAA受体的作用存在差异有关。

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Inhibition Effects and Mechanism of Ornidazole Enantiomers on Central Nervous System in Mice*

WEI Ting-ting1,SUN Ji-hong1,HAN Lu-wei2,WANG Zhi-qiang2,JI Hui1**
1Department of Pharmacology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd,Nanjing 210038

Objective:The aim of the study was to investigate the central inhibition effect and mechanism of R-ornidazole through the γ-aminobutyric acid(GABA)ergic systems.Methods:The chloride influx was estimated in primary cultured prefrontal cortical neurons with treatments of R/S-ornidazole or GABA. After treatments of R/S-ornidazole ordiazepam,the GABAAreceptor α1subunits expression in primary cultured prefrontal cortical neurons was determined.The anxiolytic effect of R-ornidazole was measured with elevated plus maze test(EPM)in mice.Results:Compared with S-ornidazole,both R-ornidazole and GABA increased chloride influx and R-ornidazole significantly increased GABAAreceptor α1subunits expression.In addition,R-ornidazole showed anxiolytic effect in mice in the elevated plus maze test.Conclusion:The inhibition mechanism of R-ornidazole on central nervous system in mice may be through the modification of GABA ergic systems.

R/S-ornidazole;Cl-channel;GABA ergic systems

R965

A

1673-7806（2015）01-009-04

国家重大新药创制科技重大专项资助项目（No．2008ZX09101-101）

魏婷婷，女，硕士生，研究方向：神经药理学E-mail:sunnytingtingwei@126.com

**通讯作者季晖，女，教授，博士生导师，研究方向：生化药理与老年病药理 E-mail:huijicpu@163.com

2014-08-03

2014-10-08