黄连温胆汤改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱*

李月碧，李瑞鹏，赵 迪，杨 京，张卫华，刘 舟，刘华东，马世平**

1中国药科大学中药药理学教研室，南京 211198；2南京中医药大学，南京 210046

黄连温胆汤改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱*

李月碧1，李瑞鹏1，赵 迪1，杨 京1，张卫华2**，刘 舟2，刘华东2，马世平1**

1中国药科大学中药药理学教研室，南京 211198；2南京中医药大学，南京 210046

目的：考察黄连温胆汤改善2型糖尿病引起的大鼠糖脂代谢紊乱作用。方法：通过60天高糖高脂饲料喂养合并一次性35 mg·kg-1链脲佐霉素（STZ）腹腔注射制备2型糖尿病大鼠模型，测定血糖，筛选模型成功大鼠。将该大鼠分为空白组、模型组、二甲双胍组（0.2 g·kg-1）和黄连温胆汤3、6、12 g·kg-1三个剂量组，连续给药30天。测定血清中空腹血糖（FBG）、血清胰岛素（FINS）、糖化血红蛋白（GHB）、胰岛素敏感系数（ISI）、胰岛素抵抗系数（IRI）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHO）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）和高密度脂蛋白胆固醇（HDLC），评估黄连温胆汤对大鼠糖脂代谢紊乱的调节作用。HE染色后观察胰腺病变。结果：黄连温胆汤能降低FBG、GHB，增加ISI，降低IRI；降低血清TG、CHO和LDLC含量，升高HDLC含量；但对FINS作用不明显。此外，黄连温胆汤与模型组相比减轻了胰腺细胞变性，改善胰岛病变。结论：黄连温胆汤可以有效地改善2型糖尿病引起的糖脂代谢紊乱，保护胰腺细胞，其作用机制可能与改善胰岛素敏感性和胰岛素抵抗有关。

代谢紊乱；糖尿病；胰岛素抵抗

糖尿病是近年来的一类高发疾病，主要分为1型和2型。其中以2型糖尿病（T2DM）患者为主，占糖尿病总体人数的90%以上。2009年第20届国际糖尿病联盟（IDF）会议中指出，目前世界上已有近3亿T2DM患者，如不立即采取行动，到2030年T2DM患者将达4.4亿。T2DM是一类主要以糖脂代谢紊乱为主要特征[1]的疾病，能引起多种并发症的发生[2]。有资料表明，糖脂代谢紊乱是导致糖尿病并发症的重要原因[3]，因此糖脂代谢紊乱的改善可能对糖尿病及其并发症的治疗有重要意义。

黄连温胆汤出自《六因条辨》，由黄连、竹茹、半夏、陈皮、枳实、茯苓、甘草、生姜8味药材组成，具有清热化痰、理气和中等功效；现代临床研究发现它对T2DM具有潜在的治疗作用[4]。本实验主要针对其改善糖脂代谢紊乱的作用进行研究，为糖尿病及其并发症的治疗提供依据。

1 材 料

1.1 药材与试剂

黄连（Coptis chinensis）、竹茹（Caulis Bambusae in Taeniam）、半夏 （Pinellia ternata Breit.）、陈皮（Pericarpium Citri Reticulatae）、枳实（Citrus aurantium L.）、茯苓 （Wolfiporia cocos）、甘草（Glycyrrhizae）、生姜（Zingiber officinale Roscoe）均购自先声再康药店，由中药资源学教研室秦民坚教授鉴定确认。

葡萄糖（FBG批号：20131006147），糖化血红蛋白（GHB，批号：20140228），甘油三酯（TG，批号：20140115），总胆固醇（CHO，批号：20140115），低密度脂蛋白胆固醇（LDLC，批号：20130722），高密度脂蛋白胆固醇（HDLC，批号：20130717）测试试剂盒，胰岛素Elisa试剂盒（USA）均购自南京建成生物有限公司。

STZ购自sigma公司，用柠檬酸柠檬酸钠缓冲液（pH=4.4）配制成10 mg·mL-1的溶液，避光保存，现配现用。

1.2 仪器

酶标仪（Thermo，美国）；低温离心机（Kubota，日本）；722紫外分光光度计 （上海菁华科技仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅 （常州国华电器有限公司）；BX50型光学显微镜 （日本Olympus公司）；RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）等。

1.3 动物

清洁级雄性SD大鼠90只，购自江苏大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2009-0002，体重180～200 g。动物分笼饲养，12 h昼夜节律，室温22℃～24℃，自由饮食饮水。

2 方 法

2.1 药材处理

黄连温胆汤中各药物的比例按照清代陆廷珍《六因条辨》原方的比例（黄连∶竹茹∶半夏∶枳实∶陈皮∶茯苓∶甘草∶生姜＝4∶4∶4∶4∶6∶3∶2∶2）。将饮片浸泡30 min，水煎煮两次，每次煎30 min，用纱布趁热滤过，60℃恒温水浴浓缩至1.2 g·mL-1，冷藏备用。

2.2 动物分组与2型糖尿病模型的建立

将大鼠按体重随机分6组，分为空白组和模型1～5组。除空白组外各组均用高糖、高脂饲料（10%猪油、15%蔗糖、5%蛋黄粉、0.5%胆固醇、0.5%胆酸盐、69%常规饲料）喂养60天后，腹腔注射STZ 35 mg·kg-1。一周后测定其随机血糖，筛选随机血糖值＞13.9 mmol·L-1的大鼠作为模型成功大鼠。将模型成功大鼠60只按血糖值随机分为模型组、二甲双胍组（0.2 g kg-1）、黄连温胆汤低、中、高三个剂量组（生药材量3、6、12 g·kg-1）6组，每组10只，并于每日9～11时进行一次灌胃给药，连续给药30天。

2.3 血液样本和组织样本的收集

给药结束后，禁食12h，各组大鼠眼眶取血2mL。静置后，3500 r·min-14℃离心10 min，吸取上层血清，保存于-20℃备用。之后每组留3只大鼠，其余大鼠麻醉并处死，再断头取血约4 mL置于已加入0.5 mL 15%的EDTA Na抗凝溶液中，上下颠倒混匀。静置30 min后，1000 r·min-1离心10 min（4℃），弃上清液，洗涤2～3次后，取沉淀，即血细胞。取血细胞1 mL加双蒸水1.5 mL，用手激烈振摇数分钟后，制得溶血液，保存在-20℃备用。

将每组留取的3只大鼠麻醉后，进行心室灌注100 mL PBS和150 mL 4%多聚甲醛，取出大鼠胰腺，置于10%福尔马林溶液中固定，备用。

2.4 生化指标的测定

从-20℃取出血清，待样本解冻后，按试剂盒说明书要求测定FBG、TG、CHO、LDLC、HDLC含量，ELISA法测定FINS含量。并按照Haffner等[5]在Homa模型中的方法测IRI和ISI：

胰岛素抵抗系数的计算式：IRI=FBG×FINS/ 22.5；

胰岛素敏感指数[6]：ISI=-Ln（FBG×FINS）。

2.5 GHB的测定

从-20℃取出血溶血液，解冻后用试剂盒说明书进行酸化、水解、显色等步骤，并测定溶血液中血红蛋白含量，最后计算每10 g血红蛋白中糖化血红蛋白的吸光度值。

2.6 胰腺的药理学检测

取出福尔马林溶液中的大鼠胰腺，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋。之后在石蜡切片机上切片，进行HE染色，在光学显微镜下观察胰腺和胰岛结构的病变。

2.7 统计学处理

3 结 果

3.1 黄连温胆汤对糖尿病大鼠糖代谢紊乱的影响

实验结果表明，糖尿病模型组大鼠与空白组相比FBG和GHB明显升高，FINS变化不明显，ISI降低，IRI升高（P＜0.05或P＜0.01）。黄连温胆汤各剂量组和二甲双胍组能明显增高ISI，降低IRI，抑制FBG和GHB含量的升高（P＜0.05或P＜0.01），但对FINS的改变不明显，结果见表1。

3.2 黄连温胆汤对糖尿病大鼠脂质代谢紊乱的影响

实验结果表明，糖尿病模型组大鼠与空白组相比TG、CHO和LDLC含量升高，HDLC含量降低（P＜0.05或P＜0.01）。黄连温胆汤各剂量组和二甲双胍组能明显增加HDLC含量，抑制TG、CHO和LDLC的含量升高（P＜0.05或P＜0.01），见表2。

3.3 黄连温胆汤对胰腺病变的影响

图1中空白组大鼠胰腺呈分叶状，内、外分泌部之胰岛细胞和腺泡上皮无变性、坏死，间质血管无充血及炎细胞浸润；而糖尿病模型组大鼠和空白组相比胰岛的结构发生明显改变，细胞数目减少且重度变性及坏死，部分导管空泡变性；而二甲双胍组和黄连温胆汤各剂量组胰岛的结构较模型组清晰，细胞变性减轻，导管空泡变性也有所减轻。

表1 黄连温胆汤对糖尿病大鼠糖代谢紊乱的影响（±s，n=10）

表1 黄连温胆汤对糖尿病大鼠糖代谢紊乱的影响（±s，n=10）

注：“##”表明与空白组相比P<0.01，统计学有极显著差异，“#”表明与空白组相比P<0.05，统计学有显著性差异；同样“**”表明与模型组相比P< 0.01，统计学有极显著差异，“*”表明与模型组相比P<0.05，统计学有显著性差异。

组别剂量（g·kg-1）FBG（mmol·L-1）FINS（mU·L-1）IRI ISI GHB（吸光度/10 g蛋白）空白—4.54±0.39 12.03±1.58 2.37±0.37 -3.97±0.16 20.08±9.17模型—25.2±7.16##10.83±1.23 13.97±6.03##-5.67±0.46##46.38±10.10##二甲双胍0.2 11.13±5.50**9.21±5.31 3.11±1.98**-4.40±0.91*19.67±6.58**黄连温胆汤（低）3 13.65±6.42*9.54±2.25 5.14±1.85*-4.89±0.54*31.67±6.81*黄连温胆汤（中）6 11.98±5.26*8.75±2.62 4.93±2.88**-4.54±0.63**30.32±3.94*黄连温胆汤（高）12 11.43±5.32**9.22±1.24 4.60±1.91**-4.54±0.53**26.06±10.45*

表2 黄连温胆汤对糖尿病大鼠脂质代谢紊乱的影响（±s，n=10）

表2 黄连温胆汤对糖尿病大鼠脂质代谢紊乱的影响（±s，n=10）

注：“##”表明与空白组相比P<0.01，统计学有极显著差异，“#”表明与空白组相比P<0.05，统计学有显著性差异；同样“**”表明与模型组相比P<0.01，统计学有极显著差异，“*”表明与模型组相比P<0.05，统计学有显著性差异。

组别剂量（g·kg-1）LDLC（mmol·L-1）HDLC（mmol·L-1）TG（mmol·L-1）CHO（mmol·L-1）空白—0.77±0.13 0.74±0.18 0.73±0.18 1.40±0.12模型—4.99±1.81##0.48±0.11#3.71±0.57##9.22±1.49##二甲双胍0.2 1.08±0.16**0.80±0.19*0.80±0.23**3.50±0.79**黄连温胆汤（低）3 1.35±0.55**0.72±0.19*2.24±0.75**6.10±1.57**黄连温胆汤（中）6 1.12±0.46**0.85±0.26*2.15±0.42**5.56±1.06**黄连温胆汤（高）12 0.97±0.30**1.33±0.47**1.94±0.57**5.26±0.91**

图1 黄连温胆汤对胰腺病变的影响

4 讨 论

T2DM是现代人类常见病多发病，目前普遍认为T2DM的发病，是遗传和环境因素所致的综合结果。胰腺是胰岛聚集部位，分泌胰岛素从而调节糖脂代谢。胰岛细胞根据分泌功能不同分为胰岛A细胞和B细胞，其中胰岛B细胞是胰岛素的主要分泌细胞。STZ是一种选择性破坏胰腺B细胞的毒性物质，是目前制备糖尿病模型的常用试剂之一[7]。而体内过多的糖和脂质摄入引起的糖毒性和脂毒性是加剧胰岛B细胞损伤甚至凋亡的主要原因[8-9]。本文采用长期的高糖高脂饮食配合小剂量STZ腹腔注射制备糖尿病大鼠模型。在胰腺的病理切片中，能明显地观察到模型组大鼠的胰腺中胰岛结构不清，细胞重度变性，血管空泡变性等现象，这表明模型建立成功，糖尿病导致了大鼠胰岛功能受损，而黄连温胆汤给药组对这一病变有一定的改善作用。

胰岛素是调节糖脂代谢的重要激素[10]，由胰腺B细胞分泌入血，分布到全身各处，与各处胰岛素受体结合，激活胰岛素信号通路，从而调节全身各处的糖脂代谢等。胰岛素抵抗指正常的胰岛素无法引起胰岛素的正常生理应答，即胰岛素敏感性降低。ISI和IRI是近年来人们评估胰岛素敏感性和胰岛素抵抗的两项重要指标。在本实验中T2DM模型组大鼠血清中胰岛素含量与正常大鼠相比无明显变化，但ISI降低，IRI升高；这提示糖尿病中胰岛素的分泌并没有出现很大变化，但胰岛素敏感性降低，发生了胰岛素抵抗。实验结果显示，二甲双胍组和黄连温胆汤各剂量组与模型组的相比能明显升高ISI，降低IRI，升高的血糖血脂指标也相应的有所降低。因此可以推测二甲双胍和黄连温胆汤可能是通过改善了胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，从而改善了糖脂代谢紊乱的状况。

综上所述，黄连温胆汤能有效地改善2型糖尿病大鼠体内的代谢紊乱状况，其作用机制可能与改善胰岛素敏感性和胰岛素抵抗有关。

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Protective Effect of Huanglian Wendan Decoction on Metabolism Disorder in a Rat Model of Type 2 Diabetic Mellitus

LI Yue-bi1,LI Rui-peng1,ZHAO Di1,YANG Jing1,ZHANG Wei-hua2**,LIU Zhou2,LIU Hua-dong2,MA Shi-ping1**1China Medicine University Chinese Medicine Pharmacology,Nanjing 211198;2Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046

Objective:The aim of this study is to investigate the therapeutical effect of Huanglian Wendan decoction on metabolism disorder in a rat model of type 2 diabetic mellitus.Methods:60 days high-glucose-high-fat diet and 35 mg·kg-1streptozocin(STZ)injection once were used to bulid a rat model of type 2 diabetic mellitus.Following,metformin hydrochloride(0.2 g·kg-1),berberine hydrochloride(0.2 g· kg-1),HLWDD(3,6,12 g·kg-1)were given by gavage for 30 days except normal and model groups after randomly divided into six groups.Relate measurements about glucose and lipid metabolism in serum were did,and insulin sensitivity index (ISI)and insulin resistance index (IRI)were calculated to evaluate the improvement of Huanglian Wendan decoction on metabolism disorder.The pathological damage of pancreas was observed by a HE staining.Results:30 days administration of Huanglian Wendan decoction to the rats reduced fast blood glucose(FBG),glycosylated hemoglobin(GHB),IRI,triglyceride(TG),total cholesterol (CHO)and low density lipoprotein cholesterol (LDLC)in serum;increased ISI and high density lipoprotein cholesterol (HDLC).However,its effect to FINS can not significantly observed.Treatment of HLWDD to rats also protected them from pathological damage of pancreas.Conclusion:Treatment of Huanglian Wendan decoction protects rats from metabolism disorder and pathological damage of pancreas in a rat model of type 2 diabetic mellitus significantly.Its mechanism may related to the improvement on insulin sensitivity and insulin resistance.

Metabolism disorder;Diabetic mellitus;Insulin resistance

R965.1

A

1673-7806（2015）01-001-04

教育部博士点基金（20113237120007）；江苏省中医药局科技项目（LZ13001）；江苏省高校自然科学研究计划（12KJD360002）

李月碧，女，硕士研究生，研究方向：中药及复方药理研究 E-mail:liyuebi19900920@163.com

* *通讯作者马世平，男，博士研究生导师，研究方向：中药及复方药理研究 E-mail:spma@cpu.edu.cn；张卫华，男，讲师，博士，研究方向：治法与方剂配伍的理论与实验研究 E-mail:zwhtcm@sina.com

2014-10-15

2014-10-29