翘嘴鳜F2家系选育及微卫星亲子鉴定

杨 凯 成为为 高银爱 王青云 罗 峰 夏儒龙 朱思华程颖红 邓国乔

(武汉市水产科学研究所, 武汉 430207)

研究简报

翘嘴鳜F2家系选育及微卫星亲子鉴定

杨 凯 成为为 高银爱 王青云 罗 峰 夏儒龙 朱思华程颖红 邓国乔

(武汉市水产科学研究所, 武汉 430207)

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)俗称“桂花”、“季花”, 隶属于鲈形目(Perciformes), 鳜属(Siniperca), 是鳜属鱼类中体型最大、生长最快的一种[1]。其肉质坚实细嫩、味道鲜美、营养丰富、无肌间刺, 是一种经济价值很高的名贵鱼类, 在我国淡水养殖业中占有重要的经济地位[2]。目前,养殖的翘嘴鳜亲鱼大多从野生资源中捕获而来, 缺乏定向选育, 加之一些繁育单位不注重亲鱼的保种和留种工作, 甚至为了生产上的方便, 选择个体小, 性成熟早的个体作为亲本, 致使翘嘴鳜种质质量急剧下降。因此, 良种选育已经成为我国鳜养殖产业健康和可持续发展亟待解决的重要课题之一。

家系选育是获得优良品种的重要手段之一, 其可以增加物种某一种群体内具有育种价值的基因频率, 降低育种不需要的基因频率, 使个体更适用于特定的生产目的和要求[3]。在家系选育过程中, 准确地掌握系谱信息,可以有效地指导亲本选留, 从而缩短育种周期, 提高育种效率。然而, 环境因素对遗传参数有较大的影响, 因此,为了降低环境因素对遗传参数的准确评估, 需要利用遗传标记对混养的不同家系进行亲子鉴定[4]。传统的外部物理标记如颜色、电子标记等有明显的不足之处[5], 相比之下, 微卫星分子标记具有共显性遗传、数量多、分布广泛均匀、多态性丰富及检测方便等优点, 是进行系谱追踪有力的工具[6]。诸多研究证明, 微卫星分子标记可以有效地确认混养群体的家系信息[7], 是进行选择育种研究非常有效的标记手段。

本研究以武汉市水产科学研究所家系选育的 F2翘嘴鳜个体为研究对象, 采用微卫星标记技术对翘嘴鳜混养家系进行亲子鉴定, 意在为翘嘴鳜后续家系选择育种工作的顺利开展提供生长速度快且抗病力强的候选亲本和分子标记辅助育种技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2010年 5月, 分别从广东省佛山市南海区石啃鱼苗场和武汉市佳恒水产有限公司引进种苗 5000尾, 各选留500尾生长速度快、体型好、健壮个体作为广东和湖北地区选育基础群体。2011年5月, 从上述 2个基础群体中选取生长性状优良的雌雄个体建立翘嘴鳜 F1家系, 并从中挑选了5个具有生长优势家系。2013年5月, 以上述5个优良家系为亲本, 采用家系内个体巢式交配原则构建了 30个 F2家系, 其中广东养殖群体家系 7个, 编号为GDF2-1、GDF2-2、GDF2-3、GDF2-4、GDF2-5、GDF2-6、GDF2-7; 湖北养殖群体家系 23个, 编号为 HBF2-1、HBF2-2、HBF2-3、…、HBF2-21、HBF2-22、HBF2-23。建系时, 采用人工单独受精, 隔离孵化及养殖至5 cm时,从每个家系各挑选1000尾个体进行同塘混养。养殖6个月后, 干塘起捕至网箱中, 挑选体重较大的个体(≥500 g)作为下一代育种材料并进行亲子鉴定研究。

1.2 实验方法

样本收集及DNA提取 剪取翘嘴鳜24尾亲本及F2子代鳍条组织浸泡在95%的乙醇中, 然后置于4℃下保存备用。采用经典的酚氯法提取基因组DNA。

引物来源 15个微卫星引物来源于已发表的文献[8], 序列及其扩增等信息见表1, 引物由上海生工生物工程技术公司合成。

PCR扩增及分型 PCR反应体系12.5 μL: 含模板DNA 30—50 ng, 10×buffer (含Mg2+)1.25 μL, dNTP 0.4 μL (2.5 mmol/L), 引物0.5 μL(2 μmol/L), Taq酶0.1 μL(5 U/L),添加 ddH2O至终体系。反应条件为: 95℃预变性 5min; 94℃变性35s, 退火35s(温度见表1), 72℃延伸40s, 35个循环; 72℃后延伸10min。

PCR扩增产物在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上230V电泳4h, EB显色, 凝胶电泳成像。以分子标记物pBR322/ Msp Marker (天根生化有限公司)确定等位基因的大小。

表1 微卫星引物基本信息Tab. 1 The basic information of the primer

亲子鉴定分析 使用CERVUS3.0软件对每一个体的基因型进行亲权分析, 计算出各微卫星位点的等位基因频率、杂合度、多态信息含量、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率, 根据LOD值对每一个体的父母作出鉴定。

生长性状评估 根据亲子鉴定结果, 使用 SPSS 19.0软件(SPSS公司, 美国)对 F2进行方差分析、显著性检测和LSD多重比较, 评估其生长性状。

2 结果

2.1 F2混合群体家系鉴定

试验共选育F2代个体486尾, 利用15对微卫星引物对翘嘴鳜486尾混养个体进行PCR扩增, 然后进行基因分型并统计其基因型。根据统计的基因型数据, 应用CERVUS3.0软件对混养群体进行家系鉴定, 15个微卫星座位在混养家系检测值见表2。

为了保证鉴定结果准确, 根据LOD值鉴定候选亲本时, 只有所有的微卫星座位全部匹配, 并符合亲本交配体制才确认为亲子关系, 最终确认了 470个混养后裔的父母(表 3), 其真实鉴定率为 96.7%, 低于软件分析算出的鉴定率(98.8%)(图1)。鉴定结果表明470尾翘嘴鳜个体分属于30个家系, 其后裔数目介于3—28。

2.2 生长性状评估

根据家系鉴定结果, 本研究分别计算了各家系的体质量和标准差(表3)。对优势个体数达到 15尾以上的 F2各家系平均体质量进行显著性差异分析及LSD多重比较,数量15以下家系未进行统计分析。结果显示, GDF2-5体质量显著最高, 为569.59 g, 数量为17尾; HBF2-23体质量显著最低, 为521.09 g, 数量也为17尾; 广东养殖群体家系 GDF2-2、GDF2-4、GDF2-5和湖北养殖群体家系HBF2-1、HBF2-12、HBF2-15、HBF2-22的体质量显著高于其他家系(P＜0.05), 数量达到15尾以上, 宜选育为翘嘴鳜下一代家系选育的优势亲本。

3 讨论

3.1 F2混合群体家系鉴定

准确的系谱关系对良种选育有着重要的作用, 因此必须选择合适的标记来掌握正确的系谱信息[9]。本研究使用 15个有效的微卫星标记对双亲已知的 30个家系 486尾个体的混养群体进行家系鉴定。鉴定结果表明在 486尾个体中, 当所有的微卫星座位全部匹配, 并符合亲本交配体制时, 有470尾翘嘴鳜个体确认了父母, 其真实鉴定率达96.7%。陈腾等[10]认为在采用微卫星标记进行亲子鉴定的生产实践中, 当个体识别率大于0.8时, 表明该研究所使用的微卫星标记具有较高的应用价值。因此, 本研究中所使用的微卫星标记能有效地应用于翘嘴鳜遗传改良和生产实践。

表2 15个微卫星位点在翘嘴鳜混养家系检测值Tab. 2 Detective values of the fiveteen microsatellite loci in mix-feed families of mandarin fish

表3 翘嘴鳜选育世代及体重指标 (平均值±标准差)Tab. 3 Body parameters of selective generation of superior families in mandarin fish (mean ± SD)

3.2 翘嘴鳜家系鉴定影响因素

亲本规模及其亲缘关系和标记数量及其多态性是影响家系准确性一个重要原因[4]。以往的微卫星亲子鉴定研究结果表明, 使用5—8个微卫星标记就能达到90%以上的鉴定准确率, 而在本研究中当使用超过12个微卫星标记时, 才能达到相同的鉴定准确率。这可能是因为本研究构建的30个F2家系是由5个F1家系繁育而来, 而来源于同一 F1家系的后裔亲缘关系较近, 从而增加了家系鉴定的难度。无效等位基因的存在是影响家系鉴定准确性另一个重要原因[4], 通常是由于引物结合位点的替代、插入或缺失等突变造成引物无法结合而产生。然而, 无效等位基因的存在会造成群体杂合子缺失, 从而降低鉴定准确率, 目前已在多个物种中证实了它的存在[11]。在进行亲子鉴定研究所用的 15个微卫星标记中, 有 6个微卫星标记偏离Hardy-Weinberg平衡和 3个微卫星标记无效等位基因频率超过 5%, 这些标记的使用可能会降低鉴定准确率。另外, 基因分型错误也会降低家系鉴定率。O’Reilly等[6]研究发现平均每个基因座位会产生 2%—3%分型错误率,如果个体在多个位点都出现了错误的分型结果, 就会产生错配的现象, 但如果仅在 1—2个位点出现分型错误, 可通过多基因座位的综合分析也会得到准确的结果[9]。本研究混养家系的鉴定率高达98.8%, 一方面本研究使用了较多的微卫星标记(15个); 另一方面是因为混养群体是由近交繁育而成, 微卫星位点在群体中的平均等位基因只有3.39个, 因而较少产生分型错误。

图1 翘嘴鳜F2真实家系(实际)和软件分析结果比较图Fig. 1 The comparison of real and software analysis results of F2selective generation in mandarin fish

3.3 优良家系鉴定

家系选育是根据某个性状或某几个性状明显优于其亲属、生长性能显著高于其亲属的混有不同类型的原始群体里选出一些优良个体留种, 建立几个或若干个家系并繁殖后代, 逐代与原始群体相比较, 选留那些符合原定选择指标的优良家系, 进而参加品系产量测定、繁育推广后鉴定新品种[3]。近交和选择是家系选育中建系的重要手段。一般来说, 显性性状对生长发育有较好的作用, 可通过累代近亲繁殖将显性基因纯化, 但与此同时不良作用的隐形性状也表现出来, 因此在近亲繁殖的同时, 必须进行选择。选择是选择育种最有效的方法,在选择过程中有积累显性基因, 减少隐性基因的作用,从而构建性状稳定的自交系。然后进行自交系间杂交,有利于优势性状显性基因的聚合, 进而能达到更好的育种效果。

本研究以生长性状为育种目标, 采用家系选育的方法构建了翘嘴鳜F2代家系30个, 以1.6%左右的择优率从30000尾混养群体中挑选了486尾体质量大的个体作为下一代繁育亲本。根据家系鉴定结果, 470尾个体被准确地鉴定到30个F2代家系, 每个家系个体数在3—28个, 可见, 在个体质量≥500 g的同一选育标准下, 各个家系选育出个的体数存在较大差异, 数量占有比例越大, 说明该家系群体越具备生长优势, 群体产量越高, 反之亦然。从家系繁育数量和统计学要求考虑, 对达到 15尾以上的F2家系进行统计分析。结果表明, 各个家系间存在显著的生长差异(P＜0.05), 具有进一步选育的空间和意义(表3)。综合各个家系个体数和体质量指标, 试验选育的广东养殖群体家系GDF2-2、GDF2-4、GDF2-5和湖北养殖群体家系HBF2-1、HBF2-12、HBF2-15、HBF2-22共7个优势家系作为翘嘴鳜下一代家系选育的优势亲本。

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PARENTAGE ANALYSIS OF F2SELECTIVE GENERATION IN MANDARIN FISH USING MICROSATELLITES

YANG Kai, CHENG Wei-Wei, GAO Yin-Ai, WANG Qing-Yun, LUO Feng, XIA Ru-Long, ZHU Si-Hua, CHENG Ying-Hong and DENG Guo-Qiao
(Wuhan Fisheries Science Research Institute, Wuhan Academy of Agricultural Science &Technology, Wuhan 430207, China)

翘嘴鳜; 微卫星; 亲子鉴定; 家系

Mandarin fish; Microsatellite; Parentage identification; Family

Q347

A

1000-3207(2015)06-1231-05

10.7541/2015.160

2014-11-06;

2015-01-16

武汉市农业科学技术研究院创新项目(翘嘴鳜优势家系遗传距离的评估及选育CX201419; 鳜良种选育、遗传性状分析及品质评价 Cxtd201504)项目资助

杨凯(1982—), 男, 山西五台人; 硕士; 主要研究方向为遗传育种。E-mail: 593539389@qq.com

高银爱, 高级工程师; E-mail: 304104752@qq.com