胃癌中TGFβ1和Smad7 mRNA的表达及临床意义*

张德利， 马 艳， 李春辉

(承德医学院附属医院麻醉科， 河北 承德 067000)

胃癌的发生是一个多因素、多步骤的过程，涉及到多方面机制。研究表明转化生长因子 β(TGFβ)/Smads信号通路中任何一个环节出现异常都可能导致信号转导的紊乱，从而导致胃癌的发生与发展。本研究通过检测正常胃组织和胃癌中TGFβ1、Smad7基因以及蛋白的表达，分析它们与胃癌分化程度、淋巴结转移的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象:收集我院2011年12月至2012年9月手术治疗后经病理证实的胃癌组织标本60例，同时收集正常胃组织20例(切缘距离肿瘤边缘10cm以上认为正常胃组织)。60例胃癌患者中，男性38例，女性22例;年龄43－77岁，平均年龄54.8±9.7岁;其中低分化者32例，高中分化者28例;有淋巴结转移者35例，无淋巴结转移者25例。

1.2 RT－PCR所用试剂:AMV第一链cDNA合成试剂盒(BK1040)(上海生工生物工程技术服务有限公司);引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司);50bp DNA Ladder(北京天根生化有限公司MD108);肌动蛋白(β－actin)上游引物序列:5'－CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC －3'，下游引物序列:5＇－CTCCTTAATGTCACGCACGAT－3'。TGF 1上游引物序列:5'－GGCCAGATCCTGTCCAAGC－3'，下游引物序列:5'－GTGGGTTTCCACCATTAGCAC－3'。Smad7上游引物序列:5’－TTCCTCCGCTGAAACAGGG－3’，下游引物序列:5’－CCTCCCAGTATGCCACCAC －3’。

1.3 方 法

1.3.1 提取RNA及RNA定量:①充分预冷研钵，把组织从液氮罐中取出放入研钵中仔细研磨，控制每例标本质量100mg左右，研磨成粉末状后，加Trizol试剂1mL，将其击成碎块，至1.5mLEP管中，混匀室温静置5min，4℃，离心12000rpm10min，将上清移入新EP管。

1.3.2 反转录:反转录过程:1μg总RNA为模板逆转录成cDNA，反转录反应条件为:25℃，10min;37℃，50min;70℃，15min;4℃，5min。反转录反应体系见表1。

表1 反转录体系

1.3.3 聚合酶链反应

1.3.3.1 PCR 扩增反应体系，见表 2。

表2 PCR扩增反应体系

1.3.3.2 循环设置:①TGF 1扩增条件:94℃预变性5min，一个循环;94℃ 变性 30s，55℃ 退火 30s，72℃ 延伸30s，共35个循环;72℃总延伸6min。②Smad7扩增条件:94℃预变性5min，一个循环;94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸 30s，共 30个循环;72℃总延伸6min。③琼脂糖凝胶电泳结果分析:取20μL扩增产物及6μL的DNA Ladder进行2%琼脂糖凝胶电泳(120V，45min)，紫外荧光数字成像仪下照像，采用Image pro plus 7.0软件统计各条带的积分光密度值，以积分光密度值比值分析各组间差异。

1.4 统计学分析:采用SPSS17.0统计软件，计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较用方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

在胃癌组织中，TGFβ1，Smad7 mRNA的表达明显高于对照组(P＜0.05)，低分化胃癌组织中TGFβ1和Smad7 mRNA水平明显高于高中分化胃癌组织(P＜0.05)。TGFβ1，Smad7 mRNA的表达与胃癌的分化程度有关(图1)。见表3。

图1 TGFβ1、Smad7 mRNA在各组织中的表达(±s，n=6)M:100 bp DNA Marker;1:正常胃癌组织;2:高中分化胃癌组织;3:低分化胃癌组织

表3 TGFβ1 mRNA、smad7 mRNA水平的表达在不同临床病理特征中的关系

3 讨论

TGFβ是重要的细胞因子之一，对细胞分裂和增殖具有抑制作用。研究结果显示，恶性细胞对TGFβ产生抵抗作用与肿瘤的发生关系密切，TGFβ信号通路一旦改变，对靶细胞失去有效抑制作用，甚至可能促进肿瘤的发展［1］。Smad蛋白家族指的是TGFβ信号传递通路中的中转分子，从胞质进入胞核［2］。Smad7在基础状态下大部分位于细胞核中，Smad7是TGFβ信号传导途径中必需的下游分子，与多种恶性肿瘤的生物学行为有关。Smad7异常表达，拮抗了TGFβ通路，从而使其不能有效监督肿瘤细胞过度增生，导致肿瘤发生［3］。

TGFβ1调控的基因通常依赖于TGFβ1活化的下游分子R－smad(受体－smad)中的一个，即Smad2或Smad3，Smad3磷酸化和核转位主要发生在活化的细胞，Smad2激活主要发生在静止和中间细胞［4］。在炎症性肠病(IBD)病人肠道内Smad3磷酸化水平下降，伴有Smad7显著增高。研究结果表明，Smad7可通过抑制Smad3的活化磷酸化、影响Smad3/Smad4异源复合物的形成及核转位，最终拮抗TGFβ对细胞的生长抑制效应。在肿瘤的发生、发展过程中 TGFβ1与Smad7的表达是互相调节，共同发挥作用的。有研究发现，TGF－β作用较长时间(2d)后，可直接导致兴奋性信号分子Smad3的基因表达水平下降，抑制性信号分子Smad7的基因表达水平显著上升，而使胞内TGF－β信号转导功能下调，细胞对TGF－β的反应减弱。Smad3功能受高表达Smad7抑制，不能有效启动介导生长终止基因的转录，使细胞生长发生紊乱，从而有可能向恶性化发展［5，6］。此外，在体外正常皮肤成纤维细胞中，TGF－β可使Smad7的表达快速而短暂地被诱导，这就提示Smad7是TGF－β早期即刻基因作用的靶点，作用是自身负反馈调节。说明TGF－β刺激Smads信号通路功能的活化，同时对内源性Smads的表达也起到了潜在的调节作用［7］。

有研究报道TGFβ1在前列腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中呈过度表达，其过度表达在肿瘤转化、进展中起重要作用并与预后相关［8］。本实验研究发现胃癌组织TGFβ1呈过表达状态，随着胃癌临床病理分期的进展，TGFβ1表达逐渐加强，提示我们TGFβ1有可能促进胃癌的进展。这与Naef等［9］的研究结果一致，另外TGFβ1在肿瘤中高表达的原因还可能由于胃癌组织细胞失去了对TGFβ1的敏感性，导致TGFβ1的反馈性表达升高。近来的报道显示，Smad7基因扩增与胃癌，结肠癌患者的预后不良有着密切的关系。表明TGF－β信号转导抑制因子Smad7过表达是肿瘤细胞抵抗TGF－β的生长抑制作用的机制之一。最近的研究还显示，Smad7可以不依赖于TGF－β而独立发挥其生物学功能，并与肿瘤细胞凋亡的发生有关。

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