DAPT阻断Notch信号通路抑制去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及诱导其成骨分化的作用研究*

郑介柏， 刘旭良， 陈文雄， 方雄明， 刘贻运

(广州医科大学附属广州市第十二人民医院， 广东 广州 510620)

骨质疏松(osteoporosis OP)是以骨质量的丢失以及骨组织的退变为特征的骨代谢疾病。常导致骨质疏松性病理骨折，致残率较高，已成为继高血压、糖尿病后的重大老年疾病［1］。目前国内外研究发现其发病病因及愈后恢复与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的增殖和分化密切相关［2］。Notch 通路是调节BMSC向成骨细胞的增殖与分化的关键通路之一［3，4］。据报道，激活 Notch通路可促进 BMSCs的增殖，但会抑制Notch通路可促进BMSCs成骨分化。DAPT作为Notch信号通路的阻断剂，能够特异地阻断γ分泌酶的作用，从而阻止Notch信号通路的活化［5］。本实验拟通过应用Notch信号通路抑制剂DAPT，观察阻断Notch通路对于抑制SD大鼠BMSC增殖及诱导其定向成骨分化的作用。希望能为治疗骨质疏松性骨折提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物:雌性SD大鼠24只，12周龄，体重

250±30g(由广州医科大学大学城校区，动物实验中心提供)，动物级别SPF级。

1.1.2 试剂和仪器:双能X线吸收骨密度仪(DXA)，倒置显微镜，12孔培养板，超净工作台(苏州净化设备厂);二氧化碳恒温饱和湿度培养箱(Thermoforma，美国);离心机(Optima XPN，美国)1%戊巴比妥钠，75%乙醇，DMEM溶液，DMEM培养基培养基，胎牛血清(赛泰诺，美国)，0.25%胰蛋白酶，10%胎牛血清，地塞米松，维生素C，β－甘油磷酸钠，DAPT美国Calbiochem公司。

1.2 方 法

1.2.1 模型建立:1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉;大鼠取俯卧位，腹正中切口，在输卵管与子宫角交界处结扎，摘除卵巢，其中，阴性对照组(假手术组)仅在卵巢周围切除少许脂肪组织，余手术操作同上;手术完毕后，清点手术器械，缝合关闭伤口;肌肉注射青霉素钠20万单位，预防感染。(n=6)。

1.2.2 骨密度测量:术后12周，进行双能X线吸收骨密度仪(DXA)测量股骨、腰椎骨密度。

1.2.3 大鼠的BMSC分离培养及鉴定:造模成功后第12周，以颈椎脱臼法处死大鼠，处死的大鼠浸入75%乙醇10min，在SPF实验室中，无菌手术操作台上分离取出双侧股骨和胫骨，切除长骨两端关节面及干骺端，显露骨髓腔;吹打、抽吸将骨髓间充质干细胞收集于离心管中，离心;利用DMEM重悬，之后按1∶1比例加入1.073g/mL Percoll液分离，吹打重悬，将细胞悬液，接种于 10cm培养皿中;之后，置入 37℃、5%CO2、100%饱和湿度培养箱培养。培养72h后，首次换液，以后每3天换液1次，细胞80% －90%融合后用0.25%胰蛋白酶消化，传代。

1.2.4 诱导分化培养:将第2代细胞换成骨诱导培养液(含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入1×108moL/L地塞米松、50mg/L维生素 C、1×108moL/L β－甘油磷酸钠)培养，进行诱导分化。倒置显微镜观察细胞生长状况、形态特性。第2代传代培养的细胞用诱导培养液以1×106/mL的细胞密度接种于培养瓶中进行连续培养，每2－3d换液。共诱导培养3周。

1.2.5 DAPT溶液:完全溶于 DMSO，用 DMEM 培养液稀释至1.00μmoL/L，DMSO 终浓度不超过0.1%。

1.2.6 实验分组:DAPT治疗组:培养液中含有浓度为1μmoL/L 的 DAPT，药物浓度参考［6］。对照组:含等量DMSO的PBS注射液。

1.2.7 DAPT对MSC增殖的影响:MTT检测各组BMSC的增殖:12孔培养板接种细胞，分别于诱导3、5、7、9、11d，分组换液，每组6复孔，每3－4d换液。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，取6孔平均值，以时间为横坐标，吸光值(OD)为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.8 DAPT对BMSC成骨分化的影响:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase;ALP)定量测定:12孔培养板接种细胞，分别于诱导 3d、5d、7d、9d、11d 各组取 6 孔，各取上清100uL，按照试剂盒说明书进行操作，记录结果，取6孔平均值(金氏单位U/100mL)，计算ALP活性。

2 结果

2.1 骨密度测量结果:与对照组比较，模型组大鼠腰椎及股骨骨密度下降明显，差异具有统计学意义，见表1。铺满瓶底，细胞为单层分布，第2代细胞，可见其集落样生长(如图1B)。

2.2.2 诱导培养:将BMSC第2次传代后，加入诱导液进行培养，第3－4d可观察到细胞呈现梭型和多角形，其中胞体较普通的常规培养要大，到第7－8天可观察到细胞突起多，细胞核较大，有些已经形成细胞小结，具有了成骨细胞的形态特征(图1C)。

2.3 生长曲线(MTT方法):第2次传代后1－3d的细胞生长较慢，从第5天开始细胞增殖明显加快，数量增加，对照组及DAPT组BMSC到第9天增殖达到最高峰(0.541 ±0.051;0.369 ±0.043)，而后回落。自第3天开始，两组之间的OD值有统计学差异(n=6，P＜0.05)(图2)

表1模型组及对照组的DXA测定结果(n=6，±s)

表1模型组及对照组的DXA测定结果(n=6，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.01

指标 模型组 对照组腰椎 BMD(g/cm2) 0.217 ±0.041*0.284 ±0.032股骨 BMD(g/cm2) 0.169 ±0.021*0.223 ±0.027

2.2 BMSC体外培养的形态观察，见图1。

图1 BMSC体外培养形态观察结果

2.2.1 原代培养:BMSC原代细胞的特点是:均匀散布于培养瓶底，细胞呈现圆形，其中胞体较透亮、细胞核圆，与髓腔内的其它杂细胞如白细胞等共同存在。经定期换液后，去除其中大部分的悬浮细胞，可得到纯化BMSC(如图1A)。第7－8天时，BMSC相互接触可

图2 两组BMSC增殖的对比

2.4 DAPT对BMSC成骨分化的检测，ALP定量测定结果:ALP定量测定结果见图3，对照组与DAPT组ALP表达均在第7 天达到峰值(0.831 ±0.047;1.236±0.059)，第7天前两组之间ALP表达无明显差异(P＞0.05)，两组之间在第 7 天(t= －5.369)，第 9 天(t= －4.676)、第11 天(t= －3.389)ALP 表达具有统计学差异(n=6，P＜0.01)(图3)。

图3 两组ALP定量分析

3 讨论

随着我国逐渐步入老龄社会，原发性骨质疏松症是老年人，尤其是绝经后老年妇女的一种常见病、多发病，严重地威胁着老年人的身体健康。随着我国人口的不断老龄化和平均期望寿命增长，骨质疏松症将成为严重危害中老年人群身心健康和生活质量的疾病之一，随之而来的骨质疏松性骨折也给社会及家庭带来沉重的负担［7，8］。骨质疏松的发生与破骨细胞和成骨细胞的代谢失衡密切相关［9］，其中绝经后骨质疏松属于骨质疏松的一种，绝经后女性体内雌激素的逐渐缺乏，而后者的减少导致了破骨细胞造成的骨吸收大于成骨细胞的骨形成。绝经后骨质疏松症由于自身的特点:全身性骨量普遍减少、骨的微结构发生退行性变，骨的脆性增高及骨折危险性增加［10，11］。本实验通过去除大鼠卵巢成功制作了绝经后骨质疏松大鼠动物模型，并通过了骨密度检测的验证。

在已发现的少数信号通路中，有少数的信号通路是用来调节细胞的命运的，如细胞的增殖分化与死亡。Notch通路就是其中的一种。根据国内外的相关报道，Notch通路是调控BMSC向成骨细胞的增殖和定向分化的关键通路之一［12］。Notch基因发现于一个世纪前，Notch的配体常常以跨膜蛋白的形式存在，当Notch受体与配体结合后，活化的Notch受体从胞膜脱落下来后，可直接转至核内，与转录调节子结合而激活靶基因，这种传导非常的简单，并且不需要第二信使的传导;激活Notch可引发多种信号，多种调节因素通过不同机制调节Notch信号。因为Notch信号通路的这种简单的跨膜传递信号途径，具有了特异性强的优势，基本避免其他信号的干扰。Notch经过两步蛋白酶水解过程，释放出Notch的胞内段结构域NICD，其中介导这酶切过程的关键蛋白酶之一为γ分泌酶。据报道，Notch通路对于MSC细胞的成骨分化十分重要，有人发现在Prxl增强子控制下的Notch的过表达会诱导间充质前体细胞的增殖，抑制其分化。那么通过抑制Notch通路的激活是否能达到促进BMSC向成骨细胞的分化呢?

DAPT作为Notch信号通路的阻断剂，能够特异地阻断γ分泌酶的作用，从而抑制Notch信号通路的活化。本实验通过DAPT的应用，阻断了Notch通路。通过MTT法检测细胞增殖活力，MTT法是检测细胞增殖活力的一种简便、准确的方法，其中活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中是MTT比色法的原理与关键，通过比色，对A值进行分析，可反映细胞生长和存活情况。在实验中我们观察到与对照组相比，DAPT阻断Notch通路后，BMSC的增殖受到了抑制。这与目前的相关研究结果是一致的，但其整体的生长曲线与对照组相似，这也说明了在调控BMSC增殖的过程中应该涉及到多条信号通路的共同作用。

在骨的发生、发育和修复与成骨细胞密切相关，因此成骨细胞也成为骨组织工程的关键细胞。ALP活性是成骨细胞分化的早期指标，在体外钙化中起关键性作用，反映了细胞的成骨活性。本研究发现在抑制Notch通路活化后，ALP活性实验组明显高于对照组，BMSC向成骨细胞的定向分化是增强的。

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