共培养条件对农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

黄 顺，董金星

(1.安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100；2.安徽科技学院 资源与环境学院，安徽 凤阳 233100)

共培养条件对农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

黄 顺1，董金星2

(1.安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100；2.安徽科技学院 资源与环境学院，安徽 凤阳 233100)

目的：探讨根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的最佳转化条件。方法：以平菇ACCC52857为受体，利用潮霉素 B 抗性基因作为筛选标记，建立根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化体系；探讨乙酰丁香酮(AS)的浓度，根癌农杆菌的浓度，共培养的时间和共培养的温度这四个条件对转化的影响。结果：根癌农杆菌菌液浓度为OD600=0.6～0.7，诱导培养基中添加200μmol/L AS，25℃共培养3～5d，其转化效率最高。结论：对根癌农杆菌介导平菇菌丝转化体系条件的优化，为提高遗传转化效率，以及菌株选育工作奠定基础。

根癌农杆菌；平菇；共培养

根癌农杆菌介导转化 (Agrobacterium-mediated transformation ，ATMT)方法[1]在各种真菌的转化中得到的广泛的应用，具有转化效率高和遗传体系稳定的优势。其大部分转化子为单拷贝的T-DNA插入[2]，成为构建突变体的有力工具[3]。1998年，De Groot等人ATMT法转化多种丝状真菌[4]，利用分生孢子与农杆菌共培养成功获得转化子。2000年Chen 等人在前人的基础上对农杆菌介导转化的方法作了修改。通过子实体菌褶组织与农杆菌共培养，在同源启动子的作用下实现了双孢蘑菇的高效转化[5]。2001年Mikosch等人成功的利用双孢蘑菇的菌丝进行T-DNA转化[6]。利用子实体组织与农杆菌共培养可以获得较高的转化效率，但子实体与营养菌丝相比存在取材受时间限制较大的问题；而菌丝和分生孢子转化效率略低，但材料易获得。本研究在前期试验的基础上，利用根癌农杆菌介导转化的方法，通过对乙酰丁香酮(AS)浓度，根癌农杆菌的浓度，共培养的时间和共培养的温度这四个条件的分析，寻找最佳的转化条件，以期提高根癌农杆菌转化平菇菌丝体的效率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 平菇ACCC52857，根癌农杆菌EHA105，质粒pBI121-hyg为本研究室保存。

1.1.2 贮存液 M-N溶液：30g MgSO4·7H2O，15g NaCl，溶于1L水中；微量元素溶液：ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O各100mg溶于1L水中；K4缓冲液：218g K2HPO4溶于1L水中，用磷酸调节pH至4.9；1% CaCl2溶液：1g CaCl2溶于100mL水中；50%甘油：50mL甘油与50mL水互溶；20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶于水中，定容至100mL；100mg/mL卡那霉素(Kanamycin)：1g卡那霉素溶于10mL水中，过滤除菌；100mmol/L乙酰丁香酮(Acetosyringone (AS))：0.0197g乙酰丁香酮溶于1mL 70%乙醇，过滤除菌，现用现配。

1.1.3 培养基 肉汤培养基(LB)：10g蛋白胨，5g酵母抽提物，10g NaCl，pH 7.5，定容至1L；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：200g去皮土豆，20g葡萄糖，3g KH2PO4，1.5g MgSO4·7H2O，15g琼脂，定容至1L；诱导培养基(IM)：0.8mL K4缓冲液，20mL M-N溶液，1mL 1% CaCl2溶液，5mL微量元素溶液，2.5mL 20% NH4NO3溶液，5mL甘油，40mL 1M MES(2-N-吗啉代乙烷磺酸)缓冲液，10mL 20%葡萄糖溶液，2mL卡那霉素溶液，2mL乙酰丁香酮溶液，定容至1L；共培养培养基(CCM)：5mL 20%葡萄糖溶液，10g琼脂，其他成分与IM培养基相同；选择培养基(SM)：PDA培养基中含有250mg/L潮霉素(Hygromycin B)和100mg/L链霉素。LB培养基用于培养根癌农杆菌；PDA培养基用于培养平菇菌丝体；IM培养基用于根癌农杆菌诱导[7]；CCM培养基用于平菇菌丝体与根癌农杆菌共培养；SM培养基用于筛选平菇菌丝转化子。

1.2 方法

1.2.1 平菇菌丝的培养 将4℃保存的平菇菌丝在PDA平板中活化。制作套嵌平板，取边长0.5cm×0.5cm大小的活化菌种块置于内层平板中央，25℃培养至生长到平板边缘。

1.2.2 根癌农杆菌的转化和培养 重组质粒pBI121-hyg采用CaCl2法导入到根癌农杆菌EHA105中，筛选得到的阳性克隆子。在LB (含卡那霉素100mg/L、利福平25 mg/L)平板上划线，28℃培养3d，挑取单菌落接种于5mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃、200 rpm震荡培养过夜，以1%的接种量转接于100mL LB培养基(含卡那霉素100mg/L)中，培养至所需浓度。

1.2.3 根癌农杆菌的诱导培养 各浓度的根癌农杆菌菌液于3000 rpm，10min离心收集菌体，将细胞重悬于含有不同浓度AS(100、150、200、250、300 μmol/L)100mL IM培养基中，于28℃、200 rpm诱导培养3h。

1.2.4 共培养 将诱导培养3h后的农杆菌细胞，3000 rpm 10min离心收集菌体，将细胞重悬于冷凉至50℃左右的100mL CCM培养基中，混合倒入内层平板与外层平板的间隙中，于25℃下避光培养3d、5d、7d。

1.3 数据处理

所有样品均准备3个平行，实验结果以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 AS浓度对转化效率的影响

影响 ATMT 转化效率的因素主要有AS浓度、共培养时间和共培养温度、以及供体细胞和受体细胞的比例等。首先考察了不同浓度AS对转化效率的影响，按照1.2.3的方法，在IM培养基中添加不同浓度的乙酰丁香酮，结果如图1。

试验结果表明，随着AS浓度的升高，转化效率逐渐升高，但当浓度大于200μmol/L时，对转化效率的提高影响较小，综合考虑，选择AS浓度为200μmol/L为最适浓度。

2.2 根癌农杆菌浓度对转化效率的影响

根据方法1.2.2，将农杆菌培养至不同浓度(OD600=0.4、0.5、0.6、0.7、0.8)，进行共培养转化，结果如图2，随着农杆菌浓度的增加转化效率逐渐提高，但浓度过高，在后续的筛选工作出现较多的农杆菌污染现象，影响筛选，从而导致整体的转化效率降低。因而确定农杆菌的最佳浓度为OD600 =0.6～0.7 。

2.3 共培养温度对转化效率的影响

如图3所示，分别在20℃、25℃、30℃进行共培养，在共培养温度为25℃是获得最高的转化效率，而20℃的转化效率高于30℃，说明较高的共培养温度不利于转化。

2.4 共培养时间对转化效率的影响

试验结果显示(图4) :随着共培养时间的增加转化效率提高，共培养时间为5d时转化效率最高，当培养至7d时，由于农杆菌污染较严重，导致转化效率降低。比较共培养3d和7d的转化率，其差异不显著，确定共培养的时间为3～5d。

3 结论与讨论

本试验以平菇ACCC52857为受体，建立根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化体系，优化试验条件。

根癌农杆菌介导的遗传转化法具有成本低、稳定性好、操作方便和重复性好等优点[9]，目前已有很多国内外学者对其进行了多方面的研究[10-11]。影响转化效率的因素，主要有根癌农杆菌及受体菌的种类、根癌农杆菌的浓度、共培养培养基的成分、乙酰丁香酮的添加、共培养的时间和温度[12]等。

本试验结果显示，AS的浓度影响转化效率，随着AS的浓度的增加，转化效率随之增加，但当浓度大于200μmol/L时，其影响作用减小。

根癌农杆菌的菌液浓度也影响了转化效率，在一定范围内，随着菌液浓度的增加，转化效率逐渐增加，达到一定值时，再增加菌液浓度，转化效率不再增加反而有下降的趋势。其原因可能是根癌农杆菌抑制了平菇菌丝的生长，而且高浓度的根癌农杆菌会对之后复筛增加难度。

共培养的时间和温度是影响转化效率的重要因素。过高或过低都不利于转化，通过不同温度的共培养试验，结果得出25℃时转化效率最高。共培养时间的长短也与转化效率密切相关，培养时间过长会产生假阳性克隆，培养时间过短又无法完成根癌农杆菌的侵染。

试验通过对根癌农杆菌EHA105介导转化平菇菌丝的条件探索，得到平菇ACCC52857转化最优条件：根癌农杆菌菌液的最适浓度为OD600=0.6～0.7，诱导培养基中添加200μmol/L AS，25℃共培养3～5d。

[1]钱科，胡昌华．根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的影响因子研究进展[J]．中国医药指南，2012，10(9)：371-373．

[2]RUIZ-DIEZ B. Strategies for the transformation of filamentous fungi[J]. Journal of Applied Microbiology, 2002, 92(2): 189-195.

[3]GOUKA R J, GERK C, HOOYKAAS P J, et al. Transformation ofaspergillusawamoribyAgrobacteriumtumefaciens-mediated homologous recombination[J]. Nature Biotechnology, 1999, 17(6): 598-601.

[4]DE GROOT M J, BUNDOCK P, HOOYKAAS P J, et al.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi[J]. Nature Biotechnology, 1998, 16(9): 839-842.

[5]CHEN X, STONE M, SCHLAGNHAUFER C, et al. A fruiting body tissue method for efficientAgrobacterium-mediated transformation ofAgaricusbisporus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(10): 4510-4513.

[6]MIKOSCH T P, LAVRIJSSEN B, SONNENBERG A M, et al. Transformation of the cultivated mushroomAgaricusbisporus(Lange)using T-DNA fromAgrobacteriumtumefaciens[J]. Current Genetics, 2001, 39(1): 35-39.

[7]郭慧，杨哲，邢来君，等．根癌农杆菌介导的日本曲霉转化体系的建立[J]．微生物学报，2011，51(1)：115-121．

[8]黄亚丽，潘玮，蒋细良，等．根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展[J]．生物技术通报，2007(3)：111-114．

[9]钱科．根癌农杆菌介导的橘青霉遗传转化体系的建立及应用[D]．重庆：西南大学，2012．

[10]黎明，刘萌，黄云雁，等．根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化体系的建立及优化[J]．中国生物工程杂志，2012，32(1)：56-63．

[11]陈东亮，李纪元，范正琪，等．根癌农杆菌介导真菌遗传转化的影响因素及应用[J]．安徽农业科学，2010，38(7)：3317-3320．

(责任编辑：李孟良)

Conditions of Co-Culture on the Efficiency ofAgrobacterium-Mediated Transformation ofPleurotusostreatus

HUANG Shun1, DONG Jin-xing2

(1.College of Life Science, Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China；2.College of Resources and Environment, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100，China)

Objective:Optimization of theAgrobacterium-mediated transformation condition ofPleurotusostreatusmycelia is studied. Methood:Based on earlier experiments,PleurotusostreatusACCC 52857 was used as the host strain and Hygromycin B resistant gene was used as selective marker, and the transformation system of ATMT was established. This article explores the impact for the transformation from four conditions, including the concentration of acetosyringone(AS) andAgrobacteriumtumefaciens, co-culture temperature and co-culture time.Result: The best transformation condition is theAgrobacteriumtumefaciensliquid concentration for OD600 = 0.6- 0.7, induction medium adding 200μmol/L AS, co-culture 3-5 d in 25 ℃. Conclusion:The optimization of the transformation system of ATMT conditions, lay a solid foundation for improving heredity transformation efficiency and strains breeding.

Laccase;Pleurotusostreatus; Co-culture

2015-08-01

国家自然科学基金青年基金(31100070)；安徽省自然科学基金项目(1408085MC41)。

黄顺(1993-)，女，安徽省滁州市人，在读硕士研究生，主要从事微生物及相关生物技术研究。

Q-331

A

1673-8772(2015)06-0077-04