异亮氨酸对大鼠血清抗氧化水平及脾脏组织结构的影响

宫碧霜,任 曼,靳二辉,李倩倩,李秀荣,李升和

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

异亮氨酸对大鼠血清抗氧化水平及脾脏组织结构的影响

宫碧霜,任 曼,靳二辉,李倩倩,李秀荣,李升和*

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

目的:研究饮水添加不同浓度异亮氨酸对SD大鼠血清抗氧化能力及脾脏组织结构的影响。方法:清洁级断奶健康SD大鼠48只，雌雄各24只，随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组雌雄各6只，雌雄大鼠分笼饲养；各组饮水中分别添加0、0.5、2.5、5 mg/mL异亮氨酸，试验期28天。试验结束后，大鼠乙醚麻醉，按试验要求取材，检测血清总谷胱甘肽(T-GSH)和丙二醛(MDA)活性，常规制作石蜡切片，HE染色，显微观察并摄影。结果:与对照组比较，试验Ⅰ组雌鼠和试验III组雄鼠血清T-GSH活性显著升高(P<0.05)，试验Ⅰ组雌鼠和试验II组雄鼠血清MDA含量显著降低(P<0.05)。显微观察可见，试验Ⅰ组雌鼠和试验II组雄鼠脾脏脾小结增多、增大，动脉周围淋巴鞘增厚，淋巴细胞排列较密集。结论:饮水添加0.5%异亮氨酸可提高雌鼠血清抗氧化能力，改善其脾脏组织结构；添加2.5%异亮氨酸则对雄鼠血清抗氧化水平及脾脏组织结构的作用更为明显。

异亮氨酸；血清抗氧化能力；脾脏；组织结构

异亮氨酸(isoleucine, ILE)，又称异白氨酸，为机体必需氨基酸，属支链氨基酸(branched-chain amino acid, BCAA)，其味苦，溶于水，微溶于乙醇。研究表明，支链氨基酸具有氧化供能、促进蛋白质合成和抑制蛋白质降解、促进糖的异生、增强免疫力、调节母畜泌乳和调节激素分泌等功能[1]。异亮氨酸作为一种重要必需氨基酸，除影响蛋白沉积，还参与调节体内多种代谢和功能。黄红英[2]等研究发现，添加缬氨酸和异亮氨酸，可明显提高初乳的总必需氨基酸、总非必需氨基酸及总氨基酸的含量，提高哺乳母猪的日采食量和改善母猪乳品质，进而提高哺乳仔猪生长性能。路凯[3]等以增重率(weight gain rate,WGR) 和蛋白质沉积率(protein deposit rate,PR)为评价指标，得出生长中期花鲈对饲料中L-异亮氨酸的需求量分别为1.88%和1.84%饲料干重，占饲料蛋白质的4.41%和4.32%。有研究表明，葫芦巴活性成分4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine, 4-HIL)诱导脂肪细胞，呈现典型的脂肪细胞表型，诱导的脂肪细胞中有90%的细胞中富含有较大的脂滴[4]。目前，有关异亮氨酸在人和动物营养方面的研究越来越多，但有关异亮氨酸对大鼠血清抗氧化水平及脾脏组织结构影响的报道还较为少见。为此，本研究以SD大鼠为试验动物，研究饮水添加不同水平异亮氨酸对大鼠血清抗氧化能力及脾脏组织结构的影响，旨在为异亮氨酸在动物生产中的应用提供一定的理论依据和形态学资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组

选用48只SPF级初断乳SD大鼠,许可证号SCYK(浙)20140001，平均初始体重65.75 g，雌雄各半，购买自浙江省实验动物中心。按体重相近原则将雌雄大鼠均分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组雌雄大鼠各6只，雌雄大鼠分笼饲养于IVC笼具中。各处理组大鼠饮水含异亮氨酸的浓度分别为0、0.5、2.5、5 mg/mL，试验期28d。大鼠饲喂基础日粮，自由采食和饮水。

1.2 试验药品与试剂

L-异亮氨酸(1001064222)，C6H13NO2，纯度≥99%，购自美国sigma公司；总谷胱甘肽试剂盒(20150703)和丙二醛试剂盒(20150711)，购自南京建成生物工程研究所，其他常规实际均为分析纯。

1.3 试验方法

大鼠饲养结束后，用乙醚麻醉，解剖暴露心脏，真空促凝管右心房采血，室温放置30min后，3000r/min离心15min，分离血清，使用试剂盒检测血清T-GSH和MDA水平。同时立即解剖取脾脏，多聚甲醛PBS液常温固定24h以上，常规制作石蜡切片，HE染色，中性树胶封片，Olympus BX51+DP73显微摄影系统显微观察并摄影。

1.4 数据统计

试验数据以“平均数±标准差”(Mean±SD)表示，使用SPSS 19.0统计分析软件对数据进行单因素方差统计分析(ANOVA)，采用Dunnett-t检验进行显著性差异比较。

2 结果与分析

2.1 异亮氨酸对大鼠血清抗氧化能力的影响

异亮氨酸对SD大鼠血清T-GSH水平的影响见表1。表1结果显示，与对照组相比，试验Ⅰ组雌鼠血清T-GSH水平显著升高15.64%(P<0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ组雌鼠血清T-GSH水平无显著变化(P>0.05)；试验Ⅱ、Ⅲ组雄鼠血清T-GSH水平分别升高5.37%和13.26%，其中试验Ⅲ组差异显著(P<0.05)，试验Ⅰ组无统计学意义(P>0.05)。

异亮氨酸对SD大鼠血清MDA含量的影响见表2。由表2可见，与对照组相比较，试验Ⅰ组雌鼠血清MDA含量显著降低15.57%(P<0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ组雌鼠血清MDA含量无显著变化(P>0.05)；试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组雄鼠血清MDA含量分别降低11.97%、25.12%和2.47%，其中试验Ⅱ组差异显著(P<0.05)。

表1 异亮氨酸对SD大鼠血清T-GSH水平的影响(n=6)

注:同列，肩标“*”表示差异显著(P<0.05)，肩标“**”表示差异极显著(P<0.01)，下同。

Note:In the samecolumn, shoulder marked "*" mean significant difference (P<0.05), while with shoulder marked “**” indicated no difference (P<0.01).The same below.

表2 异亮氨酸对SD大鼠血清MDA水平的影响(n=6)

2.2 异亮氨酸对大鼠脾脏组织结构的影响

异亮氨酸对雌性大鼠脾脏组织结构的影响见图1。显微镜下可见，对照组雌性大鼠脾脏组织结构正常，白髓和红髓结构清晰，脾小结较多，动脉周围淋巴鞘较厚，淋巴细胞排列密集(图1-A)。与对照组相比，试验Ⅰ组雌性大鼠脾脏白髓脾小结明显增多，体积增大，动脉周围淋巴鞘增厚，淋巴细胞排列密集，红髓脾索增宽，脾窦较为明显(图1-B)；试验Ⅱ组雌性大鼠脾脏白髓脾小结体积稍有增大，动脉周围淋巴鞘有所增厚，淋巴细胞排列较为紧密(图1-C)；试验Ⅲ组雌性大鼠脾脏组织结构与对照组相比较变化不明显(图1-D)。

异亮氨酸对雄性大鼠脾脏组织结构的影响见图2。显微比较观察可见，对照组雄性大鼠脾脏白髓和红髓组织结构正常，脾小结较多，体积较大，动脉周围淋巴鞘较厚，淋巴细胞排列较为密集(图2-A)。与对照组相比，试验Ⅰ组雄性大鼠脾脏组织结构未见明显变化，其脾小结较大，动脉周围淋巴鞘较厚，白髓内淋巴细胞较密集，脾索和脾窦结构较清晰(图2-B)；试验Ⅱ组雄性大鼠脾脏白髓脾小结数量增多，体积明显增大，脾动脉周围淋巴鞘增厚，淋巴细胞排列紧密(图2-C)；试验Ⅲ组雄性大鼠脾脏脾小结增多，体积有所增大，脾动脉周围淋巴鞘较厚，淋巴细胞排列较为密集(图2-D)。

3 结论与讨论

研究表明，支链氨基酸(BCAA)是机体内重要的能源物质，具有促进蛋白质合成及抑制其分解的作用，能限制多方面免疫功能的消弱和增加病原体的受损伤状态[5]，也可作为氮源和碳骨架的供应者用于合成其他的氨基酸，如谷氨酸的合成对免疫细胞的功能有重要的作用。近年研究发现，BCAA可调节线粒体的功能和超氧化物岐化酶的表达和活性，且可通过mTOR通路调节线粒体的数量与活性，进而降低细胞的氧化损伤[6]。抗氧化酶可协同防止活性氧损伤，是生物体抗氧化的第一道防线，机体的氧化与抗氧化防御体系达到平衡时，机体细胞的损伤才能控制在最小程度[7]。杨兵等[8]研究发现，添加0.3%异亮氨酸能显著提高小香鸡GSH-PX活性，降低体内MDA浓度。本研究中雌雄大鼠血清抗氧化指标的变化特点表明，饮水补充适量异亮氨酸可提高大鼠的血清抗氧化能力，并与动物性别有着密切关系。

脾脏是哺乳动物体内最大的外周免疫器官，是具有免疫活性的T、B细胞移居和接受抗原刺激后产生免疫应答的主要部位，对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞的吞噬功能均具有重要作用[9]。杨兵等[8]研究发现，异亮氨酸对小香鸡免疫功能具有一定调节作用，可提高溶菌酶、补体C3和C4的含量及免疫球蛋白水平等。本研究试验组大鼠脾脏组织结构的变化特点显示，饮水补充0.5%异亮氨酸对雌性大鼠脾脏结构有明显改善作用，其白髓脾小结增多、增大，动脉周围淋巴鞘增厚，淋巴细胞密集，红髓脾索增宽，脾窦较明显；补充2.5%异亮氨酸对雄性大鼠脾脏组织结构则有明显改善作用。结果显示，饮水添加适量异亮氨酸对大鼠脾脏组织结构发育及机体免疫功能有较明显地促进作用，且促进作用与动物的性别有明显相关性，此结果与大鼠的血清抗氧化水平的变化规律一致，即饮水添加不同水平异亮氨酸对大鼠血清抗氧化能力及脾脏组织结构的影响不仅与异亮氨酸的添加量有关，而且与动物的性别密切相关。

研究表明，不同动物的不同生长阶段所需异亮氨酸最适量皆有差异。就仔猪每天摄入的异亮氨酸量而言，中国瘦肉型生长肥育猪饲养标准推荐的10～20kg仔猪异亮氨酸每天需要量为5.0 g，NRC(1998)的相应推荐值为6.3g。且人和动物的研究中均显示，不同性别对营养物质需求和敏感程度均有差异[10-11]。以上内容为本研究雌雄大鼠异亮氨酸最适剂量的差异提供了合理的解释。此外，本研究中雄性大鼠血清MDA含量，Ⅱ组显著降低，Ι组、Ⅲ组无作用。Ι组MDA无显著变化，是由于剂量不足，对血清的抗氧化作用不明显，而Ⅲ组无作用原因可能是异亮氨酸量过高，氨基酸间平衡被打破。日粮中必需氨基酸( EAA) 的平衡效果越好, 饲养对象对日粮蛋白质的利用率就越高[12-13]。例如，饲料中L-异亮氨酸水平过高或过低会降低花鲈的增重率和蛋白质沉积率等，主要原因即是过高或过低的L-异亮氨酸水平打破了饲料中氨基酸的平衡，降低机体蛋白质的合成效率[3]。缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸同属于支链氨基酸，支链氨基酸相互间也存在平衡。有研究表明，哺乳母猪及其仔猪日粮中缬氨酸为1.17%，异亮氨酸为0.94%，缬氨酸 ∶异亮氨酸 ∶亮氨酸为1.24 ∶1 ∶1.54的对生产性能效果最好[2]。

[1]刘春生，张大鹏，刘文宽，等．支链氨基酸在泌乳母猪营养中的研究现状[J]．饲料研究，2006(2)：31-32, 35．

[2]黄红英，贺建华，范志勇，等．添加缬氨酸和异亮氨酸对哺乳母猪及其仔猪生产性能的影响[J]．动物营养学报，2008，20(3)：281-287．

[3]路凯，徐玮，麦康森，等．生长中期花鲈对L-异亮氨酸需要量的研究[J]．水产学报，2015，39(2)：203-212．

[4]余海，吴萌，卢芙蓉，等．葫芦巴4-羟基异亮氨酸对高糖诱导小鼠3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响[J]．中国中西医结合杂志，2013，33(10)：1394-1399．

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[7]龚争，程郁昕，章敏，等．黄芩甙对肝损伤小鼠肝抗氧化功能影响的研究[J]．安徽科技学院学报，2011，25(1)：5-8．

[8]杨兵，夏先林，吴文旋．不同水平的氨基酸对小香鸡免疫性能与抗氧化性能的影响[J]．江西农业学报，2011，23(8)：158-160, 171．

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[13]刘景，方桂友，缪伏荣，等．低蛋白质氨基酸平衡日粮对高温环境下肥育猪生长性能、血清指标和蛋白质表观消化率的影响[J]．福建农业学报，2014(12)：1159-1163．

(责任编辑：马世堂)

Effect of Isoleucine on the Serum Antioxidant Levels and the Structure of Spleen in Rats

GONG Bi-shuang, REN Man, JIN Er-hui, LI Qian-qian, LI Xiu-rong, LI Sheng-he*

(College of Animal Science, AnHui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Objective:It is to study the effect of isoleucine on the serum antioxidant levels and tissue structure. Mothods:48 weaning healthy SD rats were randomly divided into four groups (n=12, equal male and female). Rats of the control group, experiment group I, II and III were treated with 0, 0.5, 2.5 and 5 mg/mL isoleucine supplemented in water. At the 28d of experiment period, the serum samples were obtained to measure total serum glutathione (T-GSH) and malondialdehyde (MDA) level; the spleen were collected to paraffin sections, HE staining, microstructure for observation. Results:Compared with the control group, the serum T-GSH levels were significantly increased (P<0.05) and the MDA level significantly decreased (P<0.05 ) in the experimental group I female rats and the experimental group III male rats. The microstructure photography shows that spleen of the experimental group I female rats and experimental group II male rats have greater splenic follicles, thicker lymphatic sheath surrounding the splenic artery and serried lymphocytes ranks. Conclusion:The results conclude that 0.5% isoleucine can increase antioxidant capacity and improve the structure of spleen in female rats and 2.5% isoleucine has significant effect on antioxidant capacity and the structure of spleen in male rats.

Isoleucine; Serum Antioxidant function; Spleen; Tissue structure

2015-07-06

国家自然科学基金(31501968)；安徽高校自然科学研究重点项目(KJ2015A296)；安徽省农业科技成果转化资金项目(1504032001)；安徽科技学院自然科学基金(ZRC2014453)；安徽科技学院大学生创新创业训练计划项目(108792015059)。

宫碧霜(1992-)，女，安徽省宿州市人，在读硕士研究生，主要从事动物微量元素营养与健康研究。*通讯作者：李升和，教授，E-mal:lish@ahstu.edu.cn。

S816.7

A

1673-8772(2015)06-0001-05