镇海水库拟柱孢藻的分离鉴定和氮磷对其生长的影响

戴景峻 彭 亮 于 婷 雷腊梅

(暨南大学生态学系, 水体富营养化与赤潮防治广东普通高校重点实验室, 广州 510632)

镇海水库拟柱孢藻的分离鉴定和氮磷对其生长的影响

戴景峻 彭 亮 于 婷 雷腊梅

(暨南大学生态学系, 水体富营养化与赤潮防治广东普通高校重点实验室, 广州 510632)

以分离自广东省镇海水库的拟柱孢藻 N8为对象, 探究其在不同磷浓度及氮磷浓度组合下的生长情况。结果表明, 拟柱孢藻N8对磷的适应范围很宽, 在0.02—5.12 mg/L磷浓度下均能生长, 最适生长磷浓度范围为0.16—5.12 mg/L, 磷浓度的升高能显著延长拟柱孢藻的对数生长期和提高生物量。动力学分析表明,拟柱孢藻N8有较低的KSP值, 对磷元素的亲和性较高, 在磷营养贫乏的环境下更容易形成优势。在氮磷组合实验中, 低氮(0.5 mg/L)显著抑制拟柱孢藻的生长, 且这种生长抑制不受磷浓度的影响; 而在低磷(0.04 mg/L)条件下, 水体中氮浓度的增加会显著促进拟柱孢藻的生长, 拟柱孢藻在高氮中磷和高氮高磷下的生长显著优于其他氮磷组合条件。研究表明, 广东省水库拟柱孢藻的生长受磷的限制较弱, 氮是其生长的决定因子。

镇海水库; 拟柱孢藻; 氮磷营养盐; 生长特性; 南亚热带

拟柱孢藻 (Cylindrospermopsis raciborskii) 是一种具有固氮能力的丝状水华蓝藻, 1978年于匈牙利巴拉顿湖首次被记录[1]。该藻被认为是热带亚热带地区的特征性种类, 有大量的报道称其在澳大利亚北部、南美洲、非洲等国家或地区的湖泊和水库中存在并成为优势种[1,2]。在过去 20多年, 拟柱孢藻在温带地区出现的频率明显增加, 已经遍布整个欧洲和澳大利亚, 近年来在美国、波兰、日本、加拿大、新西兰等国家的水体中都有发现拟柱孢藻[3—9]。研究认为拟柱孢藻具有较强的适应能力, 随着全球气候变暖, 其种群分布不断由热带亚热带地区向温带地区扩散[10]; 但作为热带特征性种类, 其最佳生长温度普遍在25℃以上, 因此拟柱孢藻在热带水体中可常年占据优势乃至形成持续性水华, 但在亚热带和温带地区, 该藻仅能在夏季较高的温度条件下形成优势种[11,12]。拟柱孢藻备受关注的另一原因是它能产生包括拟柱孢藻毒素(Cylindrospermopsin, CYN)在内的多种毒素, CYN可抑制蛋白质合成, 损伤 DNA, 具广泛的细胞毒性, 严重危害人类健康[13]。

研究表明, 拟柱孢藻的表型可塑性强, 对光照温度等关键生长因子有较宽的生态辐[14]。该藻还具有一些独特的生物学特性, 如良好的漂浮能力、耐受低光强、能固氮、可利用有机氮源、抵抗牧食者捕食等[1,15]。拟柱孢藻对磷有较高的亲和力并且具有储存磷的能力[16], 它的胞外碱性磷酸酶活性较高,能有效裂解并利用有机磷[17]。上述特征均赋予拟柱孢藻更强的竞争能力, 使其能在复杂多变的环境下生长并在合适的条件下暴发形成水华。

尽管目前对拟柱孢藻的适应性特征已有较深入的认识, 但研究发现拟柱孢藻拥有多种生态型, 每种生态型对水深、光强、营养物乃至有机物等环境因子的偏好都不一样[18], 有必要根据地域探讨有利于拟柱孢藻生长的关键因子。在我国的南亚热带地区, 近几年来拟柱孢藻逐渐成为水库优势种并在部分水库形成水华[19], 成为危害该地区水库水质安全的首要有害藻类。本文以从广东省开平市镇海水库中分离的拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskiiN8)为材料, 在不同氮、磷浓度条件下进行单因子和正交实验, 研究拟柱孢藻对营养盐的适应性特征, 为揭示该地区拟柱孢藻水华发生机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 藻种分离、培养和鉴定

实验用藻种C. raciborskii N8分离于广东省开平市镇海水库(22°34′7′′N、112°32′58′′E)。在光学体视显微镜下, 用玻璃毛细管从水库水样中挑取单根藻丝, 无菌水洗涤5—6次后转入3 mL BG-11培养基中[20], 置于28℃恒温光照培养箱(FPG3莱福仪器)中培养, 4周左右藻丝明显生长后, 转入250 mL锥形瓶中扩大培养, 光源采用白色荧光灯, 光照强度为 30 μE/(m2·s)(用LI-1400辐照度仪测定), 光暗周期为12h∶12h。

对所分离的拟柱孢藻依据其形态特征进行种类鉴定。取适量生长良好的藻液制作临时装片, 在10×40倍显微镜(ZEISS AX10)下, 记录50根藻丝的长度以及单个细胞和异形胞(不一定出现)的形态、长度和宽度。同时采用针对16S rDNA设计的蓝藻特异性引物对27F和809R进行PCR扩增[21], PCR产物送深圳华大基因科技服务有限公司进行序列测定, 获得的序列采用BLAST进行相似性分析。

1.2 不同磷浓度的单因子实验

以BG-11培养基为基础(BG-11中硝态氮浓度为247 mg/mL, 磷浓度为5.43 mg/mL), 调整磷浓度,配置9个磷浓度梯度培养基: 0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 mg/L, 每个处理组设置3个平行。取一定体积生长良好的拟柱孢藻液以5000 r/min离心15min, 弃去上清液, 用15 mg/L的NaHCO3溶液洗涤后再次离心, 重复3次, 然后用无菌水稀释, 饥饿培养2d后接种。实验采用单种批量培养, 取相同体积藻液转移至装有30 mL不同磷浓度培养基的试管中, 起始接种叶绿素a浓度为(31.0± 2.0) μg/L。置于(25±1)℃恒温光照培养箱中培养, 光照强度为30 μE/(m2·s), 光暗周期为12h∶12h。

1.3 氮、磷浓度组合正交实验

以BG-11培养基为基础, 设置低、中、高3个氮浓度(LN=0.5、MN=5.0、HN=50 mg/L)和低、中、高3个磷浓度(LP=0.04、MP=0.4、HP=4.0 mg/L), 共有(LNLP、LNMP、LNHP、MNLP、MNMP、MNHP、HNLP、HNMP、HNHP)9个处理组, 每个处理组设置3个平行。接种方法及实验条件同1.2, 起始叶绿素a浓度为(22.7±0.5) μg/L。

1.4 拟柱孢藻生长曲线和比生长速率的计算

每天定时取样, 遮光处理20min后用TD-700 Fluorometre荧光仪测定藻液叶绿素a的浓度。当每组实验每天的平均增长值低于5%时, 认为该实验组已达到最大现存量, 即可停止测定。比生长速率μ(/d)指在某一段时间间隔内藻类的生长速率, 计算公式为:

μ = ln (x2/x1) / (t2－t1)

式中, x1为t1时的生物量, x2为t2时的生物量, 此处均为叶绿素a的浓度。而t1、t2分别为拟柱孢藻指数生长期开始和结束的时间。

1.5 动力学参数的计算[22]

根据Monod方程μ=μmaxC/(C+KS)转变成

1/μ=KS/(C·μmax)+1/μmax

式中, μ为拟柱孢藻的比生长速率(/d), μmax为在饱和浓度中藻类最大比生长速率(/d), C为限制性底物的浓度(mg/L), KS为半饱和常数。以统计学的最小二乘法求出上述方程的斜率(KS/μmax)和截距(1/μmax)。截距的倒数为 μmax, 其与斜率的乘积就是半饱和常数KS。

1.6 数据分析

实验数据采用Origin 9.0作图, 采用 SPSS 16.0软件进行One-way ANOVA方差分析, 显著性水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 拟柱孢藻N8的形态学特征

从图1可知, 本实验室分离到的拟柱孢藻是单根丝体, 伪空泡多, 藻丝笔直不弯曲, 蓝绿色, 相邻的细胞壁没有缢缩, 未观察到有黏质的胶鞘。藻丝长度变化极大, 范围为17—1220 μm。没有异形胞的藻体其两端细胞的末端稍尖或钝圆。营养细胞呈圆柱形, 长3.3—14.0 μm, 宽2.3—4.3 μm。异形胞顶生, 位于藻丝一端或两端, 偶有间生, 呈长圆形或卵圆形, 长 3.5—4.5 μm, 宽 2.3—2.8 μm(图1b)。利用核苷酸序列比对检索工具BLASTN进行同源性分析表明, N8藻株的16S rDNA(Genbank序列号: KJ747394)与来自澳大利亚、德国、匈牙利、美国、巴西等国家的拟柱孢藻藻株序列相似性达99%以上。根据上述形态和分子特征, 将该藻定为Cylindrospermopsis raciborskii, 在本实验室编号为N8。

2.2 不同磷浓度对拟柱孢藻生长的影响

磷浓度为0.02—5.12 mg/L时, 拟柱孢藻均有明显的指数生长期, 各处理组叶绿素 a的峰值随磷浓度的升高而增加, 不同磷浓度组的生长趋势在第 6天后出现分歧。磷浓度为0.02—0.08 mg/L时, 拟柱孢藻生长趋势类似, 第2至第6天为指数生长期, 在第6至第10天处于稳定期, 在第10天开始进入衰亡期, 3个浓度组的叶绿素 a峰值无显著差异(P＞0.05)。而磷浓度为0.16—0.64 mg/L时, 拟柱孢藻的指数生长期维持较长时间(第2至第11天), 各处理组间叶绿素 a浓度无显著差异(P＞0.05)。磷浓度为1.28—5.12 mg/L时, 拟柱孢藻在实验期间一直处于生长期(图2)。

拟柱孢藻的比生长速率随着磷浓度的升高呈升高趋势, 在0.02—0.64 mg/L磷浓度下, 比生长速率从0.174 /d上升至0.243 /d, 在0.64—5.12 mg/L范围内的比生长速率则无明显差异。比生长速率在0.08 mg/L处有较大增长, 低于0.08 mg/L与高于 0.08 mg/L的各组间均存在显著差异(P＜0.05) (图3)。结果表明, 磷浓度大于 0.08 mg/L能显著促进拟柱孢藻的生长, 当磷浓度达到1.28 mg/L后, 磷浓度的增加对比生长速率无显著促进作用。拟柱孢藻对磷浓度有较宽的适应范围, 而最适生长范围为 0.16—1.28 mg/L。

图1 拟柱孢藻的形态照片Fig. 1 Cylindrospermopsis raciborskii N8

图2 不同磷浓度下拟柱孢藻N8的生长曲线Fig. 2 Growth curves of C. raciborskii N8 under different phosphorus concentrations

图3 不同磷浓度下拟柱孢藻N8的比生长率Fig. 3 Specific growth rates of C. raciborskii N8 under different phosphorus concentrations

2.3 拟柱孢藻N8的营养生长动力学参数

半饱和常数 KS表示生物物种对于营养物质的亲和性, 即在营养物质浓度为KS时就能使种群增值率达 μmax, 而亲和性的强弱与其半饱和常数的值成反比[22]。实验结果显示: 拟柱孢藻N8以磷为限制性底物时的半饱和常数KSP=0.008 mg/L, μmax=0.239/d。

2.4 氮、磷浓度组合正交实验

在三个低氮浓度组中, 拟柱孢藻基本停止生长,叶绿素 a浓度显著低于其他处理组(P＜0.05)。在MNLP和 HNLP组中, 拟柱孢藻的生长周期很短,指数生长时间仅3d, 叶绿素a峰值为45.3 μg/L。而MNMP和MNHP处理组的指数生长期为5d, 叶绿素 a峰值达到 73.5 μg/L。拟柱孢藻在 HNMP和HNHP下的生长最好, 指数生长期可达7d, 叶绿素a峰值可达(120±2) μg/L(图4)。

拟柱孢藻的比生长速率的最大值均出现在 MN浓度组。在氮浓度较高(MN和HN)的情况下, 高磷浓度下的比生长速率显著高于中、低磷浓度(P＜0.05) (图5)。

3 讨论

3.1 拟柱孢藻N8的形态学特征

拟柱孢藻藻丝一般长50—250 μm, 营养细胞长5.0—10.0 μm, 宽 1.5—2.5 μm, 异形胞位于藻丝一端或两端, 长3.5—10.0 μm, 宽1.5—2.5 μm[23—27]。而拟柱孢藻N8的藻丝更长(可达1220 μm), 营养细胞较宽, 异形胞则比较短, 最长仅为 4.5 μm, 可见分离自广东省镇海水库的 N8藻株具较独特的形态特征。拟柱孢藻的形态被认为具高度的可塑性, 不同生境下的营养和捕食压力差异均可导致其形态发生变化, 据Komárková等[28]的观测, 即使在同一生境的种群内, 拟柱孢藻的形态变化也非常大; 以色列的一个湖泊中该藻藻丝末端则有6种不同的形态[25]。N8藻株形态独特的原因也可能是长期实验室培养所致, 有研究表明藻丝形态与培养温度密切相关[23]。

图4 不同氮、磷浓度下拟柱孢藻N8的生长曲线Fig. 4 Growth curves of C. raciborskii N8 at different nitrogen and phosphorus concentrations

图5 不同氮、磷浓度对拟柱孢藻N8比生长速率的影响Fig. 5 Effects of different nitrogen and phosphorus concentrations on specific growth rate of C. raciborskii N8

3.2 磷浓度对拟柱孢藻N8生长的影响

能快速吸收磷并适应低磷环境的特性一直被认为是拟柱孢藻能在全球范围内快速扩张的关键因子之一[1,16], 在法国和澳大利亚的水体中, 拟柱孢藻的优势度常常在低磷条件下表现得更为明显[7,29]。本研究结果显示, 拟柱孢藻 N8在磷浓度低至0.02 mg/L时仍能维持较长时间的生长, 说明它对低磷有较强的适应性。N8藻株的比生长速率在0.64—5.12 mg/L磷浓度下差异不显著, 表明拟柱孢藻不但耐受低磷, 且能在较宽范围的磷浓度下快速生长。Bonilla等[14]指出高度的表型可塑性和宽广的环境适应性有助于拟柱孢藻适应不同的气候条件, 因此广东省拟柱孢藻的形态独特性和对磷的适应性是促进其扩张的重要因素。

本研究测定的拟柱孢藻 N8株以磷为限制性底物时的半饱和常数为 0.008 mg/L, 显著高于来自巴拉顿湖的ACT9502藻株(KSP=0.0015–0.0025 mg/L),这种差异可能是藻株自身独特性所致, 也可能与实验条件相关。本文采用的是批量培养, 而Istvánovics等[30]进行的是恒化实验。与铜绿微囊藻(KSP=0.009)、水华微囊藻(KSP=0.014)相比[31], 拟柱孢藻 N8株的KSP值更低, 因而会在磷浓度较低的水体中更具生长优势。地处南亚热带的广东省, 土壤以含铁的红壤土为主, 由此导致多数水库的入库磷浓度很低,尽管近年来人类活动干扰的加剧, 水体富营养化有升高趋势, 多数水库依然为磷限制水体[19,32], 这可能是近年来广东省水库拟柱孢藻能取代微囊藻而成为水库优势种的原因之一。

3.3 氮浓度对拟柱孢藻N8生长的影响

拟柱孢藻是一种固氮蓝藻, 当无机氮不足时,它可以进行固氮以满足生长要求[1]。但在本研究中, N8藻株在低氮浓度下(0.5 mg/L)的生长基本停止,且这种生长停滞与磷浓度的高低无关, 拟柱孢藻的生物量仅能在高氮(50 mg/L)条件下达到较高水平,这表明氮对拟柱孢藻的生长起决定作用, 固氮并没有在缺氮的情况下发挥作用。一般认为固氮需要消耗大量能量, 是拟柱孢藻最少采用的氮摄取方式[29]。Spröber等[33]提出拟柱孢藻固氮系统的停止和启动依赖于细胞自身的氮含量, 因此 N8藻株固氮酶的合成和异形胞的形成可能需要更低的氮浓度来启动。磷元素对拟柱孢藻 N8株生长的限制明显弱于氮, 在低磷条件下(0.04 mg/L), 氮浓度的升高(MN和 HN)可使拟柱孢藻维持一段时间的生长, 其生物量可在磷限制但氮充足(MPHN)的条件下达到较高水平, 这与Kenesi等[34]的研究报道一致。

4 结论

N8藻株从形态和分子角度上鉴定为拟柱孢藻,其丝体长度和细胞大小均比其他地区的拟柱孢藻大,具有较独特的形态特征。拟柱孢藻 N8的最适生长磷浓度范围为 0.16—5.12 mg/L, 半饱和常数 KSP= 0.008 mg/L, 对磷的亲和性较高, 在培养基中磷浓度低至 0.02 mg/L时仍能维持较长时间的生长, 说明该藻株耐受低磷并对磷有较强的适应性。低氮显著限制拟柱孢藻 N8的生长, 这种抑制不因磷浓度的升高而解除。相反, 氮浓度的升高可延长拟柱孢藻在磷限制性条件下的生长时间, 因此氮对拟柱孢藻N8的生长限制作用比磷更为显著。

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THE EFFECTS OF PHOSPHORUS AND NITROGEN ON THE GROWTH OF CYLINDROSPERMOPSIS RACIBORSKII N8 ISOLATED FROM THE ZHENHAI RESERVOIR

DAI Jing-Jun, PENG Liang, YU Ting and LEI La-Mei
(Department of Ecology and Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

In this study we examined the effects of nitrate and phosphate on the growth of Cylindrospermopsis raciborskii N8 that was isolated from the Zhenhai Reservoir in Guangdong Province. We used a crossed factorial design for three phosphorus levels and three nitrogen levels, and thus generated nine different growth conditions for C. raciborskii. Our results showed that C. raciborskii could adapt to a wide range of phosphorus concentrations (from 0.02 mg/mL to 5.12 mg/mL) and the optimal concentrations for the growth was between 0.16 mg/mL and 5.12 mg/mL. The exponential stage and biomass of C. raciborskii could be significantly enhanced by the increase in the phosphorus level. The kinetic analysis revealed a low KSPvalue of C. raciborskii N8. This suggested that C. raciborskii N8 could have high affinity for phosphorus and readily become the dominant species in phosphorus-lacking conditions. The results of the nitrogen and phosphorus orthogonal experiments demonstrated that when the nitrogen level was low (0.5 mg/mL), the growth of C. raciborskii N8 was markedly inhibited regardless of the phosphorus level. Moreover, at low phosphorus concentration (0.04 mg/mL) the proliferation of C. raciborskii N8 could be boosted by the increase in nitrogen concentration. It was also found that the growth of C. raciborskii N8 could be significantly improved by HNMP and HNHP treatment. The highlights of our findings were that C. raciborskii in Guangdong reservoirs was highly tolerant to low phosphorus conditions, and nitrogen could be a key factor in its growth.

the Zhenhai Reservoir; Cylindrospermopsis raciborskii; Nitrogen and Phosphorus; Growth characteristics; Southern subtropics

Q142

A

1000-3207(2015)03-0533-07

10.7541/2015.70

2014-05-05;

2014-08-14

暨南大学“国家级大学生创新创业训练计划”项目(1210559020); 广东省水利科技创新项目(2011-02)资助

戴景峻(1991—), 男, 广东大埔人; 本科生; 研究方向为藻类生物学。E-mail: 343996767@qq.com

雷腊梅, 女, 副教授; E-mail: tleilam@jnu.edu.cn