微囊藻生长及光合系统Ⅱ对重金属镉的响应

冉小飞 刘 瑞 白 芳 施军琼 吴忠兴

(西南大学生命科学学院, 三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室 重庆 400715)

微囊藻生长及光合系统Ⅱ对重金属镉的响应

冉小飞 刘 瑞 白 芳 施军琼 吴忠兴

(西南大学生命科学学院, 三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室 重庆 400715)

近年来, 随着工农业及采矿业的迅速发展, 重金属对水体环境的污染已经成为了全球性的环境问题[1,2]。镉是生物有机体的非必需元素, 在环境中以自由离子和配合物的形式存在, 且易被浮游生物吸收。被吸收后的镉一部分随着浮游生物的死亡而进入沉积物, 另一部分则随着食物链进行传递, 最后被人体吸收, 从而对人体产生毒害作用, 因此被认为是最典型的一种重金属污染物[3]。

研究表明镉能够抑制植物的生长, 破坏叶绿素的合成, 损害放氧复合体(OEC)锰稳定蛋白(MSP)的结构[4],或取代放氧复合体中的Ca2+和叶绿素a的Mg2+等[5]。水生微生物特别是藻类对镉的敏感性较强[6]。镉能减少藻类叶绿素合成[7], 抑制藻类生长及光合电子传递[8—11]。Guanzon等[12]研究表明, 镉对藻类生长及光合作用产生了显著地抑制作用。Neelam and Rai[13]研究发现镉对藻的毒性部位在于 PS Ⅱ ,然而周文兵等[14]研究表明高浓度镉胁迫对微囊藻的毒性影响不在PSⅡ和PSⅠ等部位。尽管关于藻类对镉的响应方面前人已做了大量的工作, 但是在以前的一些研究中, 主要集中探讨了短时间Cd胁迫对藻的毒性效应及抗氧化酶活性的响应, 但由于Cd浓度及处理时间的不同产生的结论也呈现出较大的差异性。因此探讨Cd胁迫对藻类毒理学机制具有重要的意义。

JIP-测定(JIP-test)是以生物膜能量流动为基础建立的分析方法, 它能较好的反映 PSⅡ反应中心及电子供体侧和受体侧的生理状态。在正常生理条件下, 典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线一般包括 O-J-I-P等相, 它记录了从起始荧光(F0)到最大荧光(Fp或Fm)的整个变化过程[15,16]。O-J-I-P曲线不仅能准确的反映了光合电子传递链中 PQ库电子受体连续下降的过程[15], 而且其获得的JIP参数也能反映光合作用大量的信息, 如: RC/CS0、ΦP0、ψ0、ΦE0等荧光参数。微囊藻是国内外水体中最常见的水华蓝藻,其水华过程产生的大量生物量的危害及后续处理值得广泛关注[17]。然而, 针对Cd对微囊藻PSⅡ荧光动力学及JIP-参数的研究未见报道。本研究是通过快速叶绿素a荧光诱导动力学曲线(OJIP)的变化, 分析了在低、中、高三个水平胁迫至96h后, Cd对微囊藻PSⅡ光合电子传递过程中的能量流动, 反应活性中心及电子传递影响, 从而揭示微囊藻对重金属 Cd的光合响应机制, 为进一步研究富营养化复合污染水体中藻类的重金属生物修复提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 藻种培养

微囊藻(Microcystis aeruginosa FACHB-205)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供。藻种置光照培养箱中, 以 MA 培养基静置培养, 培养条件: 光照强度30 μmol/(m2.s), 温度(25±1) ,℃ 光暗比12∶12。

1.2 Cd2+浓度设置

将培养至指数生长期藻种离心后, 分别接入含有250 mL培养液的500 mL的锥形瓶中, 接种OD为0.1左右。以灭菌过的50和1000 mg/L Cd2+为母液, 配制成0.2、0.5、1、5、10和20 mg/L的6个浓度。每个浓度组设置三个重复, 以不含Cd2+的MA培养基作为空白对照。每天定时摇动3次, 使藻细胞充分与培养液接触。

1.3 叶绿素a含量的测定

将藻液胁迫培养至96h, 每个处理各取5 mL的藻液进行离心, 6000 r/min, 离心10min, 去除上清液, 接着将藻细胞用 90%的丙酮在黑暗条件下提取 2次, 每次 24h,最后将提取液定容至 10 mL, 最后使用紫外分光光度计UV-2550在750、663、645、630 nm的波长下测定吸光度[18]。

1.4 快速叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)的测定

藻体胁迫培养96h后, 每个处理各取2 mL藻液置黑暗中暗适应 20min后, 测定快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)。快速叶绿素荧光诱导动力学曲线采用植物效率分析仪测定(英国汉莎科技有限公司), 测定光强为3000 µmol/(m2.s), 最大激发波长650 nm, 记录了从10 µs到2s叶绿素荧光的变化过程, 从而准确记录O-J-I-P等相[19]。藻细胞经充分暗适应后受光激发(20—50) µs时处于初始相O相, 此时PSⅡ反应活性中心处于完全开放状态, 所测得荧光为初始荧光F0[20]。O-J相的上升过程反映了光合作用的光化学阶段, J相对应于F2ms处的荧光, I相时的荧光为F30ms[21]。PSⅡ反应活性中心(RC)处于完全关闭状态, 不再接受光量子, 荧光产量达到Fp或Fm, P相出现[22], 大约在500 ms—1 s的时间范围内[23]。K相位于O相与J相之间, 此时的的荧光为F300µs[20]。快速叶绿素荧光动力学曲线由O点到P点的所有荧光需进行标准化,以对数形式进行表示。通过 OJIP曲线的变化, 获得了以下参数: RC/CS0、ΦP0、ψ0、ΦE0、ABS/RC、DI0/RC、TR0/RC、ET0/RC、M0、Sm。快速叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)的分析术语及公式如表1所示[24]。

表1 快速叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)的分析及公式[24]Tab. 1 Formulae and terms used in the analysis of the O-J-I-P fluorescence induction dynamics curve[24]

1.5 数据统计分析

生物统计分析方法使用SPSS 16.0 (IBM, USA)进行单因素方差分析(One-way ANOVA)及 LSD多重比较, P＜0.05时认为具有显著差异, 用*表示, P＜0.01时则认为有极显著差异, 用**表示。

2 结果

2.1 Cd2+对微囊藻叶绿素a含量的影响

在96h镉胁迫下, 微囊藻叶绿素a的含量随着Cd2+浓度的增加而逐渐降低(图 1)。与对照相比, Cd2+浓度为0.2 mg/L时叶绿素 a的含量没有显著的变化, 然而, 当Cd2+浓度大于0.5 mg/L时, 叶绿素a的含量受到了显著抑制(P＜0.01)。在20 mg/L Cd2+浓度下, 微囊藻叶绿素a含量为对照的12.67%。

图1 Cd2+对微囊藻叶绿素a含量的影响Fig. 1 Effects of cadmium on Chl. a in Microcysits aeruginosa

2.2 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(O-J-I-P)

在不同 Cd2+浓度胁迫下, 微囊藻快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)的变化情况如图 2所示。在低浓度Cd2+(0.2—1 mg/L)培养下, 微囊藻的相对可变荧光没有显著变化, Cd2+浓度为5和10 mg/L时, 相对可变荧光显著高于对照, 且I相和P相消失。Cd2+浓度为20 mg/L时, K相出现, 但是J、I、P等相消失。

2.3 叶绿素荧光参数的变化

在不同 Cd2+浓度胁迫下, 微囊藻荧光参数单位受光面积的反应活性中心数量(RC/CS0)、最大光化学效率(ΦP0)、光照2 ms时有活性的反应中心开放程度(ψ0)、反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额(ΦE0)的变化分别如图3所示。由图3 A可知, 微囊藻PSⅡ的RC/CS0随着Cd2+浓度增加而逐渐减少。与对照相比, Cd2+浓度为0.2 mg/L时, Cd2+对 RC/CS0没有显著影响, 当浓度高于5 mg/L时, 微囊藻RC/CS0显著降低(P＜0.01), 分别为对照的16.53%、8%、4.84%。低浓度镉为0.2 mg/L时, ΦP0显著高于对照(P＜0.05), 但镉浓度高于5 mg/L时, Cd2+胁迫显著抑制了 PSⅡ的最大光化学效率(ΦP0), 镉浓度为20 mg/L时, ΦP0为空白对照的6.76% (图3B)。ψ0随着Cd2+浓度的增加表现了而先减小后增加的趋势。当 Cd2+浓度小于 1 mg/L时, ψ0没有显著变化, 但 Cd2+浓度为 5、10 mg/L时, ψ0显著低于空白对照(P＜0.01), 但Cd2+浓度为20 mg/L, ψ0显著高于对照, 为对照的159.25% (图3C)。微囊藻ΦE0的变化规律与ψ0相似, ΦE0随着Cd2+浓度的增加呈现了先减小后增加的趋势。当Cd2+浓度为5、10 mg/L时, 微囊藻ΦE0分别为空白对照的3.17%、1.27%, 当Cd2+浓度为20 mg/L时, ΦE0为对照的10.71%(图3D)。

微囊藻叶绿素荧光参数反应活性中心所捕获的光能(ABS/RC)、反应活性中心耗散掉的能量(DI0/RC)、反应活性中心(RC)所捕获的激发能用于还原QA的能量(使QA减少从而还原成QA–, TR0/RC)、反应活性中心的捕获的光能用于电子传递的能量(QA–-QB–-PQ, ET0/RC)的变化情况(图4)。与对照相比, 当镉浓度小于1 mg/L, 微囊藻ABS/RC、DI0/RC没有明显的变化, 在Cd2+浓度高于5 mg/L条件下,微囊藻ABS/RC和DI0/RC显著高于对照(P＜0.01)。与对照相比, 在(0.2—10) mg/L的 Cd2+浓度下, Cd2+对微囊藻TR0/RC没有显著影响(P＜0.05), 当Cd2+浓度为20 mg/L时, TR0/RC显著高于对照(P＜0.01), 为对照的155.54%。ET0/RC呈现不同的特征, 在5、10 mg/L Cd2+浓度下, 微囊藻ET0/RC下降, 分别为对照的13.47%、12.82%, 而浓度为20 mg/L时, ET0/RC显著高于对照(P＜0.01)。

在不同Cd2+浓度胁迫下, 微囊藻QA的最大还原速率(M0), QA完全被还原所需要的能量(Sm)的变化如图 5所示。由图5 A可知, 与对照相比, 微囊藻M0随着Cd2+浓度的增大而逐渐增加。在Cd2+浓度为5, 10 mg/L 条件下,微囊藻的M0分别为对照的168.93%、179.85%(P＜0.01), 而在20 mg/L时, M0则显著降低(P＜0.01)。Sm趋势则与M0相反, 在5、10 mg/L Cd2+浓度下, Sm分别为对照组的0.3%、0.25% (P＜0.01), 而20 mg/L时, Sm则显著增加(P＜0.01)。

图2 Cd2+对微囊藻快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)的影响Fig. 2 Effect of cadmium on chlorophyll a fluorescence transients (OJIP) in Microcysits aeruginosa

图3 不同Cd2+浓度对微囊藻RC/CS0、ΦP0、ψ0、ΦE0的影响Fig. 3 Effects of cadmium on RC/CS0,ΦP0,ψ0and ΦE0in Microcysits aeruginosa

图4 Cd2+对微囊藻PSⅡABS/RC、DI0/RC、TR0/RC、ET0/RC的影响Fig. 4 Effects of cadmium on ABS/RC, DI0/RC, TR0/RC and ET0/RC in Microcysits aeruginosa

3 讨论

周文兵等[14]研究结果表明高浓度 Cd2+胁迫对微囊藻光合作用的抑制位点不在PSⅡ或PSⅠ等部位, 只是抑制了光合色素CPC和APC的合成。然而, 本研究却发现高浓度 Cd2+胁迫降低了微囊藻 PSⅡ的光化学活性, 表明Cd2+不仅对微囊藻 PSⅡ供体侧的电子供体和受体侧电子受体产生了毒害作用, 而且还降低了捕光色素的含量。相比周文兵等[14]的研究, 本研究中镉对微囊藻的处理时间为 96h, 为其最长处理时间的两倍。因此, 可以推测短时间的 Cd2+处理对光合色素的合成产生了破坏, 但对 PSⅡ及 PSⅠ中的电子传递过程没有影响, 但随着处理时间的延长, Cd2+对放氧复合体(OEC)及PSⅡ电子传递产生了破坏作用, 导致微囊藻光合作用受到抑制。此外, 本研究也发现不同浓度Cd2+胁迫对微囊藻生长及PSⅡ光化学活性的影响不同。在低浓度Cd2+(0.2 mg/L)胁迫下, Cd2+对微囊藻生长及 PSⅡ光化学活性没有显著影响, 支持了 Lukač和Aegerter[15]的结论, 即在低浓度镉(0.001—0.20 μmol/L)胁迫下, 镉对藻的生长没有显著的影响。在中浓度 Cd2+胁迫下(0.5—1 mg/L), Cd2+对微囊藻PSⅡ叶绿素a的合成及反应中心产生了抑制作用, 但对微囊藻的 PSⅡ的光能吸收及电子传递没有显著地影响。然而, 在高浓度 Cd2+胁迫下(5—10 mg/L), Cd2+对微囊藻的PSⅡ的光能吸收及电子传递产生了显著地毒害作用, J相迅速升高, I相和P相消失。这些结果表明在中、高浓度条件下, Cd2+使PSⅡ的反应活性中心(RC)上的 D1蛋白降解加剧[16], 导致电子传递体特别是QB易从蛋白复合体上脱落下来, 使得PSⅡ反应活性中心的数量大量减少并使大部分反应活性中心关闭, 导致了反应活性中心(RC)捕获的能量更多地用于QA还原为 QA–, 减少了用于电子传递的能量, 进而抑制了QA–到QB的电子传递, QA–大量积累, PQ库的库容量减小[20],表现为J点升高[25]。I相时电子受体主要状态为QA–QB–[26], P相时QA完全被还原, PSⅡ的反应活性中心完全关闭[26]。I相和P相消失是由于高浓度Cd2+条件下, Cd2+对PSⅡ电子传递的产生了极大的破坏。当Cd2+浓度为20 mg/L时, Cd2+对微囊藻 PSⅡ供体侧的电子供体和受体侧都的电子受体产生了毒害作用, 在此浓度下放氧复合体(OEC)受到了极大地破坏, K相出现, 表明此浓度导致了锰簇复合可能从放氧复合体上的裂解下来[27]。

综上所述, 高浓度Cd2+胁迫破坏了PSⅡ的反应活性中心, 使反应活性中心的数量降低及使部分反应活性中心关闭, 并且抑制了PS Ⅱ QA–到PQ库的电子传递, 受体侧的电子受体库容量(Sm)减小, 进而导致 J点的升高。高Cd2+浓度(20 mg/L)破坏了放氧复合体(OEC)的结构。因此,镉对微囊藻的毒性效应主要表现为抑制 PSⅡ的反应中心和电子传递, 对 PSⅡ供体侧的电子供体和受体侧的电子受体都产生了毒害, 进而抑制了光合作用。

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THE RESPONSE ON THE GROWTH AND PHOTOSYSTEM II OF MICROCYSTIS AERUGINOSA TO CADMIUM, A HEAVY METAL

RAN Xiao-Fei, LIU Rui, BAI Fang, SHI Jun-Qiong and WU Zhong-Xing
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region (Ministry of Education), Chongqing Key Laboratory of Plant Ecology and Resources Research in Three Gorges Reservoir Region, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

镉; 微囊藻; 叶绿素荧光动力学曲线(OJIP); 光合系统Ⅱ(PSⅡ); 荧光参数

Cadmium; Microcystis aeruginosa; Chlorophyll fluorescence induction curve (OJIP); Photosystem Ⅱ(PS ); Fluorescence parameterⅡ

Q948.11

A

1000-3207(2015)03-0627-06

10.7541/2015.83

2014-05-29;

2014-08-12

西南大学博士基金(SWU110065); 国家自然科学基金(31170372)资助

冉小飞(1990—), 女, 贵州沿河人; 硕士研究生; 主要从事藻类生态学研究。E-mail: 18883251847@163.com

吴忠兴(1975—), 男, 教授; 主要从事藻类生理生态及分子系统性学研究。E-mail: wuzhx@swu.edu.cn