大鼠前扣带皮层中PSD-95和nNOS在痛情绪中的作用

陈海军, 徐　静, 张传青, 施丽燕, 万燕杰,

(1. 徐州医学院 江苏省麻醉学重点实验室, 江苏 徐州, 221002;

2. 上海市浦东新区公利医院 疼痛科, 上海, 200135)

大鼠前扣带皮层中PSD-95和nNOS在痛情绪中的作用

陈海军1, 徐静2, 张传青2, 施丽燕2, 万燕杰1,2

(1. 徐州医学院 江苏省麻醉学重点实验室, 江苏 徐州, 221002;

2. 上海市浦东新区公利医院 疼痛科, 上海, 200135)

摘要:目的探讨大鼠前扣带皮层(ACC)中PSD-95和nNOS 在痛情绪中的作用。方法40只SD大鼠随机分为正常组(N组)、F组(福尔马林)、NS-CPA组(生理盐水-CPA)、F-CPA组(福尔马林-CPA)、CCI-CPA组。完成CPA训练后，将各组大鼠麻醉后取ACC，用Western blot方法检测PSD-95和nNOS蛋白的表达。结果与CPA训练前比，F-CPA组和CCI-CPA组大鼠经过出现了明显的回避行为(P<0.05)。与NS-CPA组比较，F-CPA组、CCI-CPA组大鼠ACC中PSD-95、nNOS的表达上调(P<0.05), 其中F-CPA组PSD-95的表达上调较明显(P<0.05), 而CCI-CPA组nNOS的表达上调更明显(P<0.05)。结论 大鼠ACC中PSD-95和nNOS表达上调可能参与了痛情绪的形成。

关键词:前扣带皮层; 痛情绪; PSD-95; nNOS

疼痛是一种与组织损伤或潜在损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验，从定义看它至少包含疼痛感觉(痛感觉)和疼痛情绪(痛情绪)两个基本成分。痛感觉主要感受致痛刺激的属性，包括刺激的性质、强度、位置等，也就是人们通常所说的“疼痛”；痛情绪主要涉及伤害性刺激所引起的恐惧、厌恶、焦虑、抑郁等负性情绪。目前有关疼痛的研究多集中于痛感觉，而对于痛情绪的研究不多。事实上，30%以上的慢性疼痛患者正经受着重型抑郁症的困扰[1]。前扣带皮层(ACC)是痛情绪形成的一个关键的部位，其分子基础可能是NMDA受体[2-5]。近年来研究表明PSD-95 、nNOS参与了痛感觉的中枢敏化过程, PSD-95能够与NMDA受体、nNOS连接组成信号复合物，在介导和整合NMDA受体信号转导中发挥关键性作用[6-8], 但PSD-95、nNOS在痛情绪中的作用尚未见报道。本实验拟在福尔马林诱导的条件性位置回避模型(F-CPA, 反映痛情绪的模型)大鼠的ACC观察PSD-95和nNOS的表达，为痛情绪形成机制的研究寻找新线索。

1材料与方法

1.1材料

220～280 g的雄性Sprague-Dawley大鼠，由上海实验动物研究中心提供。大鼠分笼饲养，自由摄入水和食物，室温控制在(22±1) ℃, 24 h昼夜循环光照。条件性位置回避(CPA)训练装置(上海欣软科技有限责任公司，中国)，鼠抗PSD-95单克隆抗体(1∶1 000, Millipore，USA), 兔抗nNOS单克隆抗体(1∶1 000, CST, USA)。

1.2实验分组与处理

40只SD大鼠随机分为5组，每组8只: ① 正常组(N组)：不做任何处理; ② 福尔马林组(F组)：足底注射福尔马林不进行CPA训练; ③ 生理盐水-CPA组(NS-CPA组)：足底注射生理盐水且进行CPA训练; ④ 福尔马林-CPA组(F-CPA组)：足底注射福尔马林且进行CPA训练; ⑤ CCI-CPA组：大鼠慢性坐骨神经缩窄损伤(CCI, 方法参考文献[9])14 d后进行F-CPA训练。完成CPA训练后各组大鼠用1.5%戊巴比妥钠(75 mg/kg)腹腔注射后断头取ACC, 范围冠状面从Bregma向前3.2 mm到1.2 mm, 左右旁开0.8 mm, 深2.6 mm。ACC取出后，称重，放离心管液氮冻存后-80 ℃冰箱中储存，以备Western blot检测。

1.3行为学训练

条件性位置回避(CPA)训练装由两部分组成: ① 穿梭箱：由3个不透明的室组成，2个较大的(30 cm×30 cm×30 cm)为条件训练室(A室、B室)，并排放置。较小的中性室(C室)(15 cm×20 cm×30 cm)位于条件训练室前面。各室之间通过可以移动的门(10 cm×10 cm)相通。A室和B室具有不同的特征: A室四壁为黑白相间的纵形条纹，室内洒以1%醋酸溶液，底板为粗糙带孔的塑料薄板; B室四壁为黑白相间的横形条纹，室内洒以1%桂皮水溶液，底板为光滑带孔的塑料薄板。C室四壁灰色，没有特殊的条纹，也没有特殊气味剂; ② 记录系统：在A室和B室顶部正中装有摄像头，连接计算机及显示器，能够随时观察大鼠的活动，并记录大鼠在A、B两室的停留时间。CPA训练过程参照文献[10]共4 d。条件训练前：第1天，熟悉环境，测试大鼠在A室、B室内停留时间，作为基础值。把大鼠放入C室，适应2 min后打开通往A、B两室的门，当进入某一室后将门关闭，让其在A、B两室自由穿梭探索15 min, 记录大鼠在A室、B室中分别的停留时间。排除标准：在某一室的停留时间超过总时间的80%(即720 s)。条件训练：第2天，根据随机原则，将大鼠进行平衡。关闭所有门，将大鼠随机放入A室或B室(非福尔马林匹配室)，停留45 min。第3天，在大鼠一侧后肢足底给予50 μL 5%福尔马林或生理盐水(作为对照)注射后放入另一个条件室(福尔马林匹配室)，同样停留45 min。条件训练后：第4天，测试。测试过程同第1天，记录大鼠在A室、B室中分别的停留时间。

1.4Western blot检测

将每组ACC按1 μL裂解液/100 μg组织的比例加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中，匀浆后4 ℃离心30 min, 12 000 r/min, 取适量上清液BCA法测定蛋白质浓度，其余上清液放-80 ℃冰箱中备用。每组取蛋白总量为40 μg的等量样品，加上样缓冲液震荡混匀，在100 ℃沸水中煮5 min。常规电泳转膜后封闭液封闭2h，加一抗PSD-95、nNOS, 4 ℃过夜，TBS缓冲液洗5 min×3次，二抗室温孵育2 h, 洗膜后ECL法显色,X线底片曝光。以actin为内参照，实验重复3次。

1.5统计学分析

2结果

2.1行为学测试

各组大鼠CPA训练结果显示：与CPA训练前比较，NS-CPA组大鼠CPA训练后在匹配室时间差异无统计学意义(P>0.05), F-CPA组和CCI-CPA组大鼠CPA训练后在匹配室时间显著减少，即出现了明显的回避行为(P<0.05); 与NS-CPA组比较，F-CPA组和CCI-CPA组的大鼠的回避分数(大鼠训练前在匹配室中停留的时间减去大鼠训练后在匹配室中停留的时间)显著增加(P<0.05), 见表1。

组别训练前/s训练后/s回避分数/sNS-CPA467.36±41.26451.96±35.5415.40±35.47F-CPA453.45±48.44172.72±44.28*280.72±42.14#CCI-CPA442.65±35.5573.32±26.13*369.33±39.01#

与训练前比较，*P<0.05; 与NS-CPA组比较，#P<0.05。

2.2Western blot 检测PSD-95和nNOS的表达

各组大鼠前扣带皮层内PSD-95和nNOS的表达结果显示: N组、F组、NS-CPA组大鼠ACC中PSD-95、nNOS的表达差异无统计学意义(P>0.05); 与NS-CPA组比较, F-CPA组和CCI-CPA组大鼠ACC内PSD-95、nNOS的表达上调(P<0.05), 与F-CPA组比较, CCI-CPA组大鼠ACC中PSD-95的表达下调(P<0.05)，而CCI-CPA组nNOS的表达上调(P<0.05),见图1、2。

3讨论

痛情绪是人类的主观感受，以往缺乏相应的动物模型，自从Johansen等[4]首次提出反映痛情绪的F-CPA模型后，它已被广泛应用于实验动物痛情绪机制的研究。但临床工作中疼痛病人的情绪变化(厌恶、焦虑、抑郁等)往往是在经历较长一段时间疼痛折磨之后才会显现出来，而且经历病痛的时间越久出现情绪障碍的概率越高。一份对494例慢性疼痛患者情绪障碍评估发现，其中36.4%表现为抑郁症，31.4%表现为焦虑，这远远高于急性疼痛人群的患病率[11]。为了与使痛情绪模型更加接近临床中的真实情况，本次实验设计了CCI-CPA组，即大鼠在坐骨神经缩窄损伤建立起神经病理性疼痛14 d后再进行常规的F-CPA训练。

图1 各组大鼠前扣带皮层(ACC)内PSD-95和nNOS的表达

注:N组、F组、NS-CPA组三组间,#P>0.05;与NS-CPA组比较,◆P<0.05;与F-CPA组比较,*P<0.05。图2 Westernblot电泳条带相对积分光密度值(相对于正常组)

实验中各组大鼠在经过4 d CPA训练，F-CPA组大鼠出现了明显的条件性位置回避行为，说明作者成功复制了F-CPA模型，同时值得注意的是CCI-CPA组大鼠同样产生了明显的条件性位置回避行为。进一步的回避分数分析显示，F-CPA组大鼠的回避分数明显高于NS-CPA组；与F-CPA组比较，CCI-CPA组大鼠的回避分数则更为明显。以上结果说明F-CPA组和CCI-CPA组大鼠都出现了痛情绪反应，而经历了14 d坐骨神经结扎损伤后再进行CPA训练的CCI-CPA组大鼠表现出更为强烈的痛情绪变化，这种情绪变化更接近于临床工作中长期慢性疼痛病人所伴有的情绪改变[12-13]。因此，经过改良后的CCI-CPA训练过程可能为今后探索建立更为可靠的痛情绪模型提供了线索[14-15]。

痛感觉和痛情绪分别经不同的传导通路上行投射至中枢不同脑区, ACC已被证明是参与痛情绪的高级中枢[6, 4]在反映痛情绪的F-CPA模型大鼠ACC内出现了NMDA受体NR2A和NR2B亚基表达上调，而ACC内注入NMDA受体拮抗剂可以阻止福尔马林诱导的条件性位置厌恶情绪的形成，但对福尔马林引起的急性疼痛行为反应没有影响，同时降低痛情绪导致的ACC神经元的破坏[5,16], 这些研究表明大鼠ACC内NMDA受体的激活参与了痛情绪的形成。近年来研究表明PSD-95、nNOS参与了痛感觉的中枢敏化过程[6-7]。PSD-95作为突触后致密物中的重要结构蛋白，它一方面和NMDA受体的NR2B亚基紧密相连，同时也与nNOS的PDZ结构域连接，组成受体-信号分子-调节分子-靶分子复合物，在介导和整合NMDAR信号转导中具有关键性作用[8]。因此，作者推测ACC中的PSD-95和nNOS可能参与了痛情绪形成[17-18]。

本实验中F-CPA组组大鼠产生了强烈的条件性位置回避行为，说明成功复制了痛情绪模型，同时观察到F-CPA组和CCI-CPA组大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表达显著增加；而只给予痛刺激不进行CPA训练(F组)或只进行训练不给予痛刺激(NS-CPA组)都没有引起PSD-95、nNOS的表达上调；这些结果表明，大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表达上调可能参与了痛情绪的形成。此外，从行为学结果看CCI-CPA组大鼠同样出现了明显的条件性位置回避行为，即产生了痛情绪。而与F-CPA组比较，CCI-CPA组大鼠ACC中nNOS的表达增加，PSD-95的表达虽有下降，但仍高于没有出现痛情绪反应的F组和NS-CPA组，这进一步说明大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表达上调可能参与了痛情绪的形成[19]。

总之，此实验观察到在出现痛情绪反应的F-CPA和CCI-CPA组大鼠ACC 内PSD-95和nNOS表达显著上调，这说明大鼠ACC中PSD-95和nNOS的表达上调可能参与了痛情绪的形成，其具体机制有待于进一步研究。

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Role of PSD-95 and nNOS in pain-related aversion

in anterior cingulate cortex of rats

CHEN Haijun1, XU Jing2, ZHANG Chuanqing2, SHI Liyan2, WAN Yanjie1,2

(1.KeyLaboratoryofAnesthesiology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu, 221002;

2.DepartmentofPain,PudongGongliHospital,Shanghai, 200135)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the role of PSD-95 and nNOS in pain-related aversion in anterior cingulate cortex (ACC) of rats. Methods40 SD rats were randomly divided into group N (normal group), group F (formalin), NS-CPA group (saline-CPA), F-CPA group (formalin-CPA) and CCI-CPA group. After CPA training, the rats were terminally anesthetized and the ACC was rapidly removed, and then the expression of PSD-95 and nNOS in the anterior cingulate cortex were measured by Western blot. ResultsCompared with CPA before training, there was a clear avoidance behavior in the F-CPA group and the CCI-CPA group (P<0.05). Compared with NS-CPA group, the protein expressions of PSD-95 and nNOS were significantly up-regulated in the F-CPA group and the CCI-CPA group (P<0.05), while the PSD-95 was much higher in the F-CPA group(P<0.05), and the nNOS was much higher in the CCI-CPA group(P<0.05). ConclusionUp-regulation of PSD-95 and nNOS in anterior cingulate cortex in rats may be involved in the development of pain-related aversion.

KEYWORDS:anterior cingulate cortex; pain-related aversion; PSD-95; nNOS

通信作者:万燕杰, E-mail:yanjiewan@sina.com

收稿日期:2014-11-17

中图分类号:R 338.3

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)03-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201503001